[發(fā)明專利]一種同時(shí)檢測(cè)HAT和TdT的電化學(xué)生物傳感器的制備方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910096694.6
• 申請(qǐng)日: 2019-01-21
• 公開（公告）號(hào): CN109856212B
• 公開（公告）日: 2021-02-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡宇芳;張青青;胡丹丹;馬少華;郭智勇;王邃
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 寧波大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N27/327
• 分類號(hào): G01N27/327
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明公開了一種同時(shí)檢測(cè)HAT和TdT的電化學(xué)生物傳感器的制備方法及其應(yīng)用，具體步驟如下：(1)將巰基己醇(MCH)滴加到Hg²⁺誘導(dǎo)的發(fā)卡DNA修飾電極表面，記為Electrode1；(2)分別取乙酰轉(zhuǎn)移酶p300、多肽和乙酰輔酶A在磷酸緩沖溶液中(PBS，10mM，pH7.0)充分混合，滴涂于Electrode1表面，記為Electrode2；(3)取Exo I溶液滴涂于Electrode2電極表面，在室溫下孵育，再將TdT反應(yīng)液滴于電極表面，記為Electrode3；(4)向(3)中電極表面滴加Cu²⁺，再向電極表面滴加抗壞血酸溶液，記為Electrode4，于PBS(0.1M，pH7.0)電解質(zhì)溶液中檢測(cè)電化學(xué)響應(yīng)。優(yōu)點(diǎn)是特異性好、靈敏度高、檢測(cè)速度快，并且可以同時(shí)檢測(cè)兩種酶的活性，結(jié)果準(zhǔn)確可靠、成本低。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種電化學(xué)生物傳感器及其檢測(cè)方法，尤其是涉及一種同時(shí)檢測(cè)HAT和TdT的電化學(xué)生物傳感器的制備方法及應(yīng)用，屬于功能生物材料和生物傳感技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

蛋白質(zhì)翻譯后修飾是細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)實(shí)行復(fù)雜調(diào)控和信息傳遞的基礎(chǔ)，不僅影響蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)和生物活性，還調(diào)節(jié)其亞細(xì)胞定位、代謝周期以及與其它大分子物質(zhì)的相互作用，癌癥的發(fā)生發(fā)展與蛋白質(zhì)翻譯后修飾密切相關(guān)。其中，組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶(HAT)多作用在核心組蛋白氨基酸堿性氨基酸集中區(qū)的特定賴氨酸殘基上，其基本原理是將乙酰輔酶A的乙酰基轉(zhuǎn)移到賴氨酸的NH₃⁺上。異常的組蛋白乙酰化修飾影響到惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡、增殖相關(guān)基因的調(diào)控，從而往往導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生、增殖。因此，研究HAT活性對(duì)于理解癌癥成因和進(jìn)展具有重要的意義。

末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)，是一種無需DNA模板的DNA聚合酶，能催化脫氧核苷酸結(jié)合到DNA分子的羥基端(3’-OH)從而延伸出具有“超長(zhǎng)”序列的DNA分子。TdT在一些癌癥類型中過表達(dá)，許多臨床研究還表明，TdT的表達(dá)水平和活性的改變對(duì)癌癥發(fā)展具有關(guān)鍵作用，并可能使對(duì)抗癌化療的反應(yīng)惡化。已經(jīng)在B細(xì)胞和T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)和急性髓細(xì)胞白血病(AML)中觀察到TdT過表達(dá)。通常，AML患者中的TdT表達(dá)變化很大，而在ALL患者中，TdT在約90％的病例中過表達(dá)，并且這種過表達(dá)與預(yù)后不良和對(duì)化療的反應(yīng)相關(guān)。因此，探測(cè)TdT活性對(duì)癌癥相關(guān)的基礎(chǔ)生化研究和藥物開發(fā)具有重要意義。

本發(fā)明開發(fā)了一種用于檢測(cè)HAT和TdT活性的電化學(xué)生物傳感器的制備方法及應(yīng)用。首先，由于T-Hg²⁺-T作用使得所設(shè)計(jì)的單鏈DNA形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，利用乙酰化反應(yīng)產(chǎn)物輔酶A(CoA，含有巰基)與Hg²⁺的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，使得DNA恢復(fù)單鏈結(jié)構(gòu)且能夠被核酸外切酶(Exo I)水解，如乙酰化反應(yīng)未發(fā)生，發(fā)卡結(jié)構(gòu)不能被Exo I水解，再通過TdT延長(zhǎng)形成富TDNA鏈并制備銅納米簇(CuNCs)，進(jìn)而通過銅的溶出伏安信號(hào)間接實(shí)現(xiàn)HAT和TdT活性。目前，國(guó)內(nèi)外還沒有公開任何關(guān)于此機(jī)理用于HAT和TdT活性檢測(cè)的電化學(xué)生物傳感器的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種特異性好、靈敏度高、檢測(cè)速度快、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、成本低的一種同時(shí)檢測(cè)HAT和TdT的電化學(xué)生物傳感器的制備方法及其應(yīng)用。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種同時(shí)檢測(cè)HAT和TdT的電化學(xué)生物傳感器的制備方法及其應(yīng)用，具體步驟如下：

(1)將DNA(2.5～7.5μL，0.25～0.75μM)和Hg²⁺(2.5～7.5μL，0.5～1.5μM)，混合均勻，在26～42℃下放置30～90min，滴于干凈的裸金電極(Au)表面。蒸餾水緩緩沖洗電極，然后滴加巰基己醇(MCH，2.5～7.5μL，0.1～1.5mM)室溫靜置30～90min，蒸餾水緩緩沖洗電極，記為Electrode 1。