[發明專利]一種同時檢測HAT和TdT的電化學生物傳感器的制備方法及其應用有效
| 申請號： | 201910096694.6 | 申請日： | 2019-01-21 |
| 公開（公告）號： | CN109856212B | 公開（公告）日： | 2021-02-19 |
| 發明（設計）人： | 胡宇芳;張青青;胡丹丹;馬少華;郭智勇;王邃 | 申請（專利權）人： | 寧波大學 |
| 主分類號： | G01N27/327 | 分類號： | G01N27/327 |
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| 地址： | 315211 浙江省*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 同時 檢測 hat tdt 電化學 生物 傳感器 制備 方法 及其 應用 | ||
1.一種用于檢測HAT和TdT的電化學生物傳感器的制備方法，其特征在于，具體步驟如下：
(1)將DNA和Hg2+混合均勻，在37℃下放置30～90min，滴于干凈的裸金電極表面，蒸餾水緩緩沖洗電極，然后滴加巰基己醇MCH室溫靜置30～90min，蒸餾水緩緩沖洗電極，記為Electrode 1；
其中，DNA序列為5’-3’：GGTCTCCAAAAAAAAAAGGTGTCC，用量為2.5～7.5μL，濃度為0.25～0.75μM；
Hg2+用量為2.5～7.5μL，濃度為0.5～1.5μM；
巰基己醇MCH用量為2.5～7.5μL，濃度為0.1～1.5mM；
(2)分別取乙酰轉移酶p300、多肽和乙酰輔酶A在磷酸緩沖溶液PBS中充分混合，總體積1～5μL；將反應液置于28～38℃恒溫水浴鍋中孵育25～55min；滴涂于Electrode 1，在28～40℃下放置15～45min，蒸餾水緩緩沖洗電極，記為Electrode 2；
其中，乙酰轉移酶p300用量為0.1～1.2μL，濃度為100～1200nM；
多肽用量為0.1～1.2μL，濃度為0.5～1.5mM；
乙酰輔酶A用量為0.5～1.5μL，濃度為0.5～1.5mM；
磷酸緩沖溶液PBS濃度為10mM，pH＝7.0；
(3)取Exo I溶液滴涂于Electrode 2電極表面，在室溫下孵育30～120min，而后蒸餾水緩緩沖洗電極，將總體積為2.5～7.5μL的TdT反應液，滴于電極表面，在27～42℃下放置0.5～1.5h，蒸餾水緩緩沖洗電極，記為Electrode 3；
其中Exo I溶液用量為2.5～7.5μL，濃度為0.5～75U/mL；
TdT反應液組成如下：1～3μL 3-嗎啉丙磺酸緩沖液MOPS，0.5～1.5μL 5×TdT緩沖液，dTTP和TdT；
其中3-嗎啉丙磺酸緩沖液MOPS組成如下：10mM MOPS，150mM NaCl，pH 7.6；
dTTP用量為0.5～1.5μL，濃度為5～15mM；
TdT用量為0.5～1.5μL，濃度為5～15U/mL；
(4)向(3)中電極表面滴加Cu2+，室溫孵育10～30min，蒸餾水緩緩沖洗電極；然后向電極表面滴加抗壞血酸溶液，室溫反應10～30min，蒸餾水緩緩沖洗電極，Electrode 4，于磷酸緩沖溶液PBS電解質溶液中檢測電化學響應；
Cu2+用量為2.5～7.5μL，濃度為0.5～1.5mM；
抗壞血酸溶液用量為2.5～7.5μL，濃度為1～3mM；
磷酸緩沖溶液PBS濃度為0.1M，pH＝7.0。
2.一種用于檢測HAT和TdT的電化學生物傳感器，其根據權利要求1的制備方法制備獲得。
3.一種用于檢測HAT和TdT的電化學生物傳感器的應用，其特征在于，所述用于檢測HAT和TdT的電化學生物傳感器是根據權利要求1的制備方法制備獲得的，應用于非疾病的診斷與治療目的的乙酰轉移酶p300和TdT活性檢測。
4.根據權利要求3所述的應用，其中乙酰轉移酶p300檢測限為3pM，TdT檢測限為0.0002U/mL。
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