[發(fā)明專利]基于輔酶A適配體的電化學生物傳感器的制備方法及其應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2019-01-21
• 公開（公告）號: CN109932408B
• 公開（公告）日: 2021-07-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 胡宇芳;胡丹丹;張青青;馬少華;王邃;郭智勇
• 申請（專利權(quán)）人: 寧波大學
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327;G01N27/48
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明公開了基于輔酶A適配體的電化學生物傳感器的制備方法及其應(yīng)用。首先，將CoA適配體(CoA?aptamer)通過Au?S作用修飾到電極表面，當乙酰化反應(yīng)溶液加入到電極表面后，由于生成的CoA與其適配體的特異性結(jié)合作用，阻礙了核酸外切酶(Exo I)水解，再通過末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)延長形成富C DNA鏈并制備銀納米簇(AgNCs)，進而通過Ag的溶出伏安信號間接實現(xiàn)HAT p300活性檢測。如果乙酰化反應(yīng)沒有發(fā)生，CoA?aptamer保持單鏈狀態(tài)，且能夠被ExoI水解，不產(chǎn)生電化學信號。該傳感器可以用來檢測HATp300活性并篩選其小分子抑制劑。由此發(fā)明出一種操作簡單、方便快捷、超靈敏準確的HATp300活性檢測的電化學分析方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種電化學生物傳感器，尤其是涉及一種基于輔酶A適配體的電化學生物傳感器的制備方法及其應(yīng)用，屬于功能生物材料和生物傳感技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

蛋白質(zhì)乙酰化在真核細胞中是一個重要的過程。其中，組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)是一類具有催化活性的酶，它通過將乙酰輔酶A上的乙酰基轉(zhuǎn)移至底物組蛋白或非組蛋白底物多肽的特定賴氨酸殘基上，達到調(diào)節(jié)染色體結(jié)構(gòu)進而調(diào)控基因的表達的目的。研究表明HAT表達異常經(jīng)常導(dǎo)致腫瘤疾病發(fā)生。p300是最常見的HAT，其具有廣泛的生物學功能，比如參與細胞的周期調(diào)控，基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，維持某些蛋白質(zhì)的功能及穩(wěn)定性。此外，p300在病毒癌蛋白的轉(zhuǎn)錄翻譯、胚胎的發(fā)育等方面也具有重要作用。因此，檢測HAT p300的活性有很重要的生化研究意義，也有利于制藥業(yè)發(fā)展。

目前，關(guān)于HAT p300的檢測方法主要基于乙酰化抗體，如基于多肽連接量子點以及乙酰基特異性抗體的熒光檢測方法和抗體介導(dǎo)的金納米粒子比色分析方法等。然而，這些方法都存在抗體固有的缺點，比如高成本、低穩(wěn)定性、較大差異性等。近年來，一些免抗體的測定HAT p300活性的新方法已經(jīng)引起極大關(guān)注，主要是基于乙酰化產(chǎn)物輔酶A(CoA)的電化學及熒光方法，但仍然是冰山一角，存在較大研究空間。因此，開發(fā)一種簡便、靈敏、低成本、選擇性好的HAT p300檢測手段勢在必行。核酸適配體(aptamer)是指利用指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術(shù)，從人工合成的寡核苷酸文庫中篩選得到的能夠與靶分子特異結(jié)合的寡核苷酸鏈。與靶分子相互作用時，可以通過自適應(yīng)的誘導(dǎo)契合變化和折疊，與靶分子形成穩(wěn)定的復(fù)合物。核酸適配體與靶分子的識別結(jié)合作用包含了構(gòu)象形狀的互補作用、芳香化合物的堆砌作用、帶電基團的靜電作用及氫鍵作用等核酸適配體的特異結(jié)合功能與抗體蛋白質(zhì)相似，但與抗體相比，核酸適配體具有許多獨特優(yōu)勢，如化學穩(wěn)定性強、能夠體外篩選與化學合成、可以進行化學基團的修飾、不存在免疫源性等。分析檢測領(lǐng)域，由于核酸適配體與靶分子的高特異性與高親和力，使其非常適合作為識別元件來構(gòu)成生物傳感器，進行目標分子的特異識別。

本發(fā)明基于CoA適配體(CoA-aptamer)與CoA特異性結(jié)合作用設(shè)計了HAT p300電化學生物傳感器制備方法及應(yīng)用。首先，將CoA適配體通過Au-S作用修飾到電極表面，當乙酰化反應(yīng)溶液加入到電極表面后，由于生成的CoA與其適配體的特異性結(jié)合作用，阻礙了核酸外切酶(Exo I)水解，再通過末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)延長形成富C DNA鏈并制備銀納米簇(AgNCs)，進而通過Ag的溶出伏安信號間接實現(xiàn)HAT活性檢測。如果乙酰化反應(yīng)沒有發(fā)生，CoA-aptamer保持單鏈狀態(tài)，且能夠被核酸外切酶(Exo I)水解，不能產(chǎn)生電化學信號。該傳感器可以用來檢測HAT p300活性并篩選其小分子抑制劑。基于CoA-aptamer構(gòu)建的電化學生物傳感器特異性好、靈敏度高、結(jié)果準確可靠、成本低、快速，且制備過程極其簡單。目前，國內(nèi)外還沒有公開任何基于CoA-aptamer及Ag溶出伏安法構(gòu)建的電化學生物傳感器用于檢測HAT p300及其小分子抑制劑的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提出一種基于輔酶A適配體的電化學生物傳感器的制備方法及其應(yīng)用。此方法首次將基于CoA-aptamer及Ag溶出伏安法構(gòu)建的電化學生物傳感器用于HATp300的活性檢測。