[發明專利]一種基于ITS-2基因的羊肝片吸蟲病PCR快速檢測試劑盒及應用

在審

• 申請號: 201910095854.5
• 申請日: 2019-01-18
• 公開（公告）號: CN109609669A
• 公開（公告）日: 2019-04-12
• 發明（設計）人: 楊怡;杜愛芳;陽毅敏;李閔薇;郭筱璐;陳學秋;孫洪超
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/6893
• 分類號: C12Q1/6893;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 趙杭麗

一種基于ITS?2基因的羊肝片吸蟲病PCR快速檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包含：PCR試劑管、100bp DNA Marker、250bp DNA Marker、GoldView DNA染料、溴酚藍上樣緩沖液、標準品、對照品。本發明提供的試劑盒，能夠快速檢測羊肝片吸蟲的PCR檢測，其優點是快速、靈敏、準確、價廉，是一種敏感性高、特異性強的檢測方法，大大提高了檢測準確率，降低了假陽性率。本試劑盒能夠運用于羊肝片吸蟲病的大規模檢測和防控，也可用于羊肝片吸蟲病的分子流行病學調查及療效監測。

技術領域

本發明涉及生物技術，尤其涉及一種基于ITS-2基因的羊肝片吸蟲病的PCR檢測試劑盒，能夠快速檢測羊糞中肝片吸蟲蟲卵，以達到快速檢測羊肝片吸蟲的目的。

背景技術

肝片吸蟲病是由肝片吸蟲(Fasciola hepatica)寄生于動物肝臟膽管中的一種人畜共患蠕蟲病。此病呈世界性分布，常呈地方性流行，是我國分布最廣泛，危害最嚴重的寄生蟲病之一。肝片吸蟲病可以引起人和動物的急性或慢性肝炎和膽管炎，并伴發全身性中毒現象，后期，終因惡病質而死亡。患畜食欲不振，營養不良，漸進性消瘦，生產力下降，病肝成為廢棄物，給畜牧業造成巨大經濟損失。人感染后食欲下降、嘔吐、腹瀉、消瘦、無力、氣喘、貧血，有時顫抖、出汗等。患病動物是主要傳染源，羊是最重要的終末宿主，也是主要傳染源。調查顯示，云南部分地區山羊、黃牛、水牛的感染率分別為25％、100％和80％，川西北牦牛和藏羊的感染率分別為23％和11％，四川綿陽市奶牛的感染率為17.8％，湖南牛肉感染率為2.35％。

目前通用的檢測方法是糞便反復水洗沉淀法或尼龍篩兜集卵法后于顯微鏡下觀察，該方法簡便易行，但費時費力，敏感性較低，容易誤判，ELISA方法容易造成假陽性和假陰性，而IHA法則操作繁瑣，而且需要相應的設備與試劑，也不利于基層地區推廣應用。因此，急需研究一種經濟實惠、簡便快捷的診斷方法。PCR檢測方法操作簡單，敏感性和特異性都很高，且能達到快速診斷的目的，利于推廣。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于ITS-2基因的羊肝片吸蟲病PCR快速檢測試劑盒，該試劑盒包含：PCR試劑管、100bp DNA Marker、250bp DNA Marker、GoldView DNA染料、溴酚藍上樣緩沖液、標準品、對照品；其中PCR試劑管中包含10×PCR Buffer、LA Taq DNA聚合酶，dNTP、ddH₂O、檢測用引物。

所述檢測用引物分別為肝片吸蟲ITS-2上游引物和肝片吸蟲ITS-2下游引物共2條：

標準品序列為肝片吸蟲(Fasciola.hepatica)具有SEQ ID No：3的核苷酸序列，具體序列見序列表。

對照品分為陽性對照品和陰性對照品，陽性對照為羊肝片吸蟲DNA片段的DNA樣本，陰性對照為無羊肝片吸蟲DNA的DNA樣本。

以上試劑均保存于-20℃，盡量減少反復凍融。

本發明的另一個目的是提供所述試劑盒在檢測羊肝片吸蟲中的應用。通過以下步驟實現：每次檢測均應設立陰性對照和陽性對照。標準品用ddH₂O稀釋為21.2ng/μl。

(1)PCR反應管制備：總體積為25μl。PCR試劑管中包括10×PCR Buffer 2.5μl，dNTP2μl，LA Taq DNA聚合酶0.25μl，上下引物各0.8μl，ddH₂O 17.65μl，保存于-20℃。取PCR試劑管液于冰上融化，加入濃度21.2ng/μl的樣本DNA(分別為待檢測樣本、標準品、陽性對照品、陰性對照品的DNA，分別加在反應管內)1μl于PCR反應管中充分混和后瞬時高速離心5s。