[發(fā)明專利]一種基于ITS-2基因的羊肝片吸蟲病PCR快速檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910095854.5
• 申請(qǐng)日: 2019-01-18
• 公開（公告）號(hào): CN109609669A
• 公開（公告）日: 2019-04-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊怡;杜愛(ài)芳;陽(yáng)毅敏;李閔薇;郭筱璐;陳學(xué)秋;孫洪超
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6893
• 分類號(hào): C12Q1/6893;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 趙杭麗

1.一種基于ITS-2基因的羊肝片吸蟲病PCR快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于，該試劑盒包含：PCR試劑管、100bp DNA Marker、250bp DNA Marker、GoldView DNA染料、溴酚藍(lán)上樣緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品；其中PCR試劑管中包含10×PCR Buffer、LA Taq DNA聚合酶，dNTP、ddH₂O、檢測(cè)用引物，

所述檢測(cè)用引物分別為肝片吸蟲ITS-2上游引物和肝片吸蟲ITS-2下游引物共2條：

上游引物 GTACCGTCGCTATATGAAAATAGC

下游引物 GACATCTTGAACGCATATTGC。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于ITS-2基因的羊肝片吸蟲病PCR快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于，標(biāo)準(zhǔn)品序列為肝片吸蟲(Fasciola.hepatica)，其核苷酸序列如SEQ ID No:3所述。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于ITS-2基因的羊肝片吸蟲病PCR快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于，對(duì)照品分為陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品，陽(yáng)性對(duì)照為羊肝片吸蟲DNA片段的DNA樣本，陰性對(duì)照為無(wú)羊肝片吸蟲DNA的DNA樣本。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于ITS-2基因的羊肝片吸蟲病PCR快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于，試劑盒保存于-20℃，盡量減少反復(fù)凍融。

5.權(quán)利要求1所述試劑盒在檢測(cè)羊肝片吸蟲中的應(yīng)用。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)：

(1)PCR反應(yīng)管制備：總體積為25μl，PCR試劑管中包括10×PCR Buffer 2.5μl，dNTP 2μl，LA Taq DNA聚合酶0.25μl，上下引物各0.8μl，ddH₂O 17.65μl，保存于-20℃，取PCR試劑管液于冰上融化，加入濃度21.2ng/μl的樣本DNA 1μl于PCR反應(yīng)管中充分混和后瞬時(shí)高速離心5s；

(2)擴(kuò)增檢測(cè)：PCR反應(yīng)管置于PCR儀上，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性1min、56℃退火1min、72℃延伸1min共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存；

(3)檢測(cè)結(jié)果判定：稱取1g瓊脂糖于100ml的0.5×TBE電泳緩沖液中，混合均勻幷加熱溶解，然后加入5μl GoldView DNA染料，傾倒凝膠板，凝膠冷卻凝固后，將取10μl PCR產(chǎn)物與適量上樣緩沖液混合，加入凝膠孔中進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后取出凝膠成像儀下觀察幷拍照，標(biāo)準(zhǔn)品孔和陽(yáng)性對(duì)照孔均有目的條帶而陰性對(duì)照孔無(wú)任何條帶說(shuō)明PCR反應(yīng)檢測(cè)成功，被檢樣本孔出現(xiàn)的電泳條帶與標(biāo)準(zhǔn)品孔、陽(yáng)性對(duì)照孔相應(yīng)條帶大小一致約400bp左右大小則判定為陽(yáng)性，反之則為陰性。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，每次檢測(cè)均應(yīng)設(shè)立陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，標(biāo)準(zhǔn)品用ddH₂O稀釋為21.2ng/μl。