[發明專利]一種丙二酸鹽克羅諾桿菌CRISPR分型方法

有效

• 申請號: 201910095638.0
• 申請日: 2019-01-31
• 公開（公告）號: CN109797232B
• 公開（公告）日: 2020-10-09
• 發明（設計）人: 曾海燕;吳清平;李程思;張菊梅;楊小鵑;王涓;丁郁;陳謀通;張淑紅;葉青華;雷濤
• 申請（專利權）人: 廣東省微生物研究所(廣東省微生物分析檢測中心);廣東環凱微生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6869;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星;朱聰聰

本發明公開了一種丙二酸鹽克羅諾桿菌CRISPR分型方法。本方法通過對丙二酸鹽克羅諾桿菌的四種CRISPR分子進行DNA測序，提取序列中的間隔序列，根據幾者的間隔序列組合確定丙二酸鹽克羅諾桿菌的CRISPR型別。本發明方法簡單、快速、低成本、分辨率高于MLST分型方法，無環境污染，對實驗室設備要求低，且CRISPR分子保存有歷史侵染的噬菌體及質粒等諸多信息，可聯合數據庫實現全國甚至全球標準化分子溯源，適合推廣至食品、檢驗檢疫等領域。

技術領域

本發明屬于分子流行病學領域，具體涉及一種丙二酸鹽克羅諾桿菌CRISPR分型方法。

背景技術

嬰幼兒的健康一直是國家和社會關注的重點，對于人工喂養的新生兒，奶粉及其替代食品的安全至關重要。克羅諾桿菌又名阪崎腸桿菌(Cronobacter(Enterobactersakazakii))為奶粉中檢出的一種強致病性細菌，可導致嬰幼兒腦膜炎，壞死性小腸結腸炎和菌血癥，死亡率高達40％到80％，已經引起了全球的高度重視。目前認為嬰幼兒配方奶粉污染克羅諾桿菌是新生兒感染該菌的主要渠道，國際糧農組織和世界衛生組織把克羅諾桿菌屬列為嬰兒配方奶粉中的A類致病菌。然而近期亦出現母乳喂養的嬰幼兒感染克羅諾桿菌的案例報道，時至今日，該菌的宿主和傳播模型尚不清晰。同時克羅諾桿菌也可以感染老年人及免疫力低下的成年人，癥狀相對較輕，近期有克羅諾桿菌引發食物中毒的報道。克羅諾桿菌屬包含7個種，丙二酸克羅諾桿菌(Cronobacter sakazakii)是其中一個重要的致病種。我們前期開展的全國食源性致病菌污染調結果顯示熟食，蔬菜和食用菌等食品中均發現丙二酸鹽克羅諾桿菌污染的情況，建立有效的分型方法對于早期分子溯源十分必要。

近年來，隨著技術的進步，除了脈沖場凝膠電泳(PFGE)技術分辨率高，重復性好，被譽為病原微生物分子分型的“金標準”之外，其他以電泳為基礎的分型手段已經少用于病原菌的分子溯源了。大量基于基因測序的分型手段應用于病原菌的分子溯源如應用廣泛的多序列分型方法(multi-locus sequence typing，MLST)，核心基因組多序列分型方法(core genome multi-locus sequence typing，cgMLST)，全基因組多序列分型方法(wholegenome multi-locus sequence typing，wgMLST)等，基于全基因組分型的效果是最佳的，但是基因組測序成本高，操作人員需要有較好的生物信息學分析基礎，推廣應用有一定的難度。

CRISPR-Cas系統是近期發現的一種新的原核生物防御外來基因組包括噬菌體入侵的有效免疫機制。CRISPR-Cas系統由CRISPR分子和cas基因組成。由于CRISPR-Cas系統中的CRISPR分子保存了細菌遭受噬菌體等基因水平轉移形式的外源DNA分子入侵的信息，且間隔序列的排列順序包含時間信息，對于追溯細菌遺傳進化規律具有其他分型方法無法企及的優勢，因此已經被用于一些病原菌的基因分型和分子溯源研究中，如結核分枝桿菌菌株的分型，沙門氏菌，鼠疫耶爾森菌和空腸彎曲桿菌等。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供一種丙二酸鹽克羅諾桿菌的CRISPR分型方法。

本發明的目的是提供一種非疾病的診斷和治療目的的丙二酸鹽克羅諾桿菌CRISPR分型方法，包括以下步驟：

a.提取待檢測菌株培養物的DNA；

b.分別以步驟a的DNA作為模板，進行CRISPR1、CRISPR2位點和CRISPR3位點的PCR擴增，其中CRISPR1位點的擴增引物為E-1F和E-1R，CRISPR2位點的擴增引物為E-2F和E-2R、CRISPR3位點的擴增引物為E-3F和E-3R；對CRISPR3位點進行PCR擴增，若E-3F和E-3R擴增出條帶，則加擴CRISPR6位點，若無擴增出條帶，則不需要加擴CRISPR6位點，其中CRISPR6位點的擴增引物為E-6F-mal和E-3R6R；

所述的引物E-1F，其序列如SED ID NO.1所示，