[發明專利]一種丙二酸鹽克羅諾桿菌CRISPR分型方法有效
| 申請號： | 201910095638.0 | 申請日： | 2019-01-31 |
| 公開（公告）號： | CN109797232B | 公開（公告）日： | 2020-10-09 |
| 發明（設計）人： | 曾海燕;吳清平;李程思;張菊梅;楊小鵑;王涓;丁郁;陳謀通;張淑紅;葉青華;雷濤 | 申請（專利權）人： | 廣東省微生物研究所(廣東省微生物分析檢測中心);廣東環凱微生物科技有限公司 |
| 主分類號： | C12Q1/689 | 分類號： | C12Q1/689;C12Q1/6869;C12Q1/04;C12R1/01 |
| 代理公司： | 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001 | 代理人： | 劉明星;朱聰聰 |
| 地址： | 510070 廣東省廣*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 丙二酸鹽克羅諾 桿菌 crispr 方法 | ||
1.一種非疾病的診斷和治療目的的丙二酸鹽克羅諾桿菌CRISPR分型方法，其特征在于，包括以下步驟：
a.提取待檢測菌株培養物的DNA；
b.分別以步驟a的DNA作為模板，進行CRISPR1、CRISPR2位點和CRISPR3位點的PCR擴增，其中CRISPR1位點的擴增引物為E-1F和E-1R，CRISPR2位點的擴增引物為E-2F和E-2R、CRISPR3位點的擴增引物為E-3F和E-3R；對CRISPR3位點進行PCR擴增，若E-3F和E-3R擴增出條帶，則加擴CRISPR6，若無擴增出條帶，則不需要加擴CRISPR6位點，其中CRISPR6位點的擴增引物為E-6F-mal和E-3R6R；
所述的引物E-1F，其序列如SED ID NO.1所示，
所述的引物E-1R，其序列如SED ID NO.2所示，
所述的引物E-2F，其序列如SED ID NO.3所示，
所述的引物E-2R，其序列如SED ID NO.4所示；
所述的引物E-3F，其序列如SED ID NO.5所示，
所述的引物E-3R，其序列如SED ID NO.6所示；
所述的引物E-6F-mal，其序列如SED ID NO.7所示，
所述的引物E-3R6R，其序列如SED ID NO.8所示；
c.分別對步驟b所述的CRISPR1、CRISPR2、CRISPR3和CRISPR6位點的PCR擴增產物進行DNA測序；
d.提取CRISPR1、CRISPR2、CRISPR3和CRISPR6位點序列中的間隔序列，根據間隔序列的組合確定丙二酸鹽克羅諾桿菌的CRISPR型別；
所述的步驟b的PCR擴增，其擴增體系為：采用50μL的PCR擴增體系，其中含有HSDNA Polymerase 0.5μL，5×PrimeSTAR Buffer 10μL，dNTP 4μL，10μmol/L的上游引物和下游引物各0.5μL，待檢測菌株培養物的DNA模版1～2μL，補齊ddH2O至50μL；擴增條件為：98℃預變性1min，然后98℃10s，57～58℃5s，72℃4min，共30次循環；72℃延伸5min；
所述的步驟b中，若利用引物E-3F和E-3R經PCR擴增反應后檢測無條帶，則利用引物E-3F和E-3R6R進行PCR擴增CRISPR3位點。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟c的DNA測序，其測序引物為步驟b的PCR擴增引物。
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