[發(fā)明專利]一種羅漢果葫蘆二烯醇合酶突變體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910095354.1
• 申請日: 2019-01-30
• 公開（公告）號(hào): CN110066785B
• 公開（公告）日: 2021-01-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬小軍;喬晶;羅祖良;石宏武;崔晟榕;廖晶晶
• 申請（專利權(quán)）人: 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所
• 主分類號(hào): C12N9/90
• 分類號(hào): C12N9/90;C12N15/61;C12N15/81;C12N1/19;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/34
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛

本發(fā)明涉及一種羅漢果葫蘆二烯醇合酶突變體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，該突變體可在酵母宿主或植物宿主中將產(chǎn)物葫蘆二烯醇的產(chǎn)量提高33.5％，滿足了在工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種羅漢果葫蘆二烯醇合酶突變體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

羅漢果甜苷,是一種葫蘆烷型三萜皂苷,不僅是傳統(tǒng)中藥羅漢果的主要活性成分,還是非糖類純天然甜味劑。藥理學(xué)研究表明羅漢果甜苷具有鎮(zhèn)咳祛痰、潤肺保肝,抗炎、抗癌、降血糖等作用,已成為為數(shù)不多的從中藥中發(fā)掘出來的具有治療功能的新型甜味劑。在羅漢果甜苷的生物合成途徑中,葫蘆二烯醇合酶是葫蘆烷型三萜骨架合成的第一個(gè)限速酶,也是此條途徑唯一的環(huán)化酶,可催化底物2,3-氧化鯊烯生成葫蘆二烯醇。隨后葫蘆二烯醇在細(xì)胞色素P450酶和和葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下,依次形成羅漢果醇和羅漢果苷。葫蘆二烯醇是葫蘆烷型三萜化合物羅漢果苷和葫蘆素的基本母核,具有抗炎、癌細(xì)胞防治功效,與很多萜類相似,葫蘆二烯醇在植物中的含量很低,因而限制了其規(guī)模化生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用。現(xiàn)有技術(shù)發(fā)現(xiàn)，羅漢果葫蘆二烯醇合酶的酶活性并不高，從而嚴(yán)重影響了該酶在酵母宿主進(jìn)行生物合成的效率，阻礙了工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于通過基因工程手段對(duì)野生型羅漢果葫蘆二烯醇合酶進(jìn)行改造，使改造后的羅漢果葫蘆二烯醇合酶突變體的催化活力和生物合成效率顯著提高，達(dá)到工業(yè)化應(yīng)用的要求。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種羅漢果葫蘆二烯醇合酶突變體，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明通過對(duì)野生型羅漢果葫蘆二烯醇合酶的氨基酸序列(SEQIDNO.4)，尤其是通過50位點(diǎn)處的氨基酸進(jìn)行點(diǎn)突變，將精氨酸置換為賴氨酸K，從而獲得SEQ ID NO.1所示的羅漢果葫蘆二烯醇合酶突變體，研究證明，該突變體可在酵母宿主或植物宿主中將產(chǎn)物葫蘆二烯醇的產(chǎn)量提高33.5％。

對(duì)所述羅漢果葫蘆二烯醇合酶突變體的其他氨基酸位點(diǎn)的保守取代形式、增加或缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的形式、氨基端截?cái)嗟男问健Ⅳ然私財(cái)嗟男问剑@些突變體形也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

本發(fā)明還提供了一種編碼所述羅漢果葫蘆二烯醇合酶突變體的基因，具有如SEQID NO.2所示的核苷酸序列。

本發(fā)明還提供了一種包含如上所述的編碼基因的重組載體。優(yōu)選地，原始載體為pCEV-G4-Km質(zhì)粒。

本發(fā)明還提供了一種攜帶所述編碼基因或所述重組載體的重組表達(dá)菌株。所述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞獲得所述重組表達(dá)菌株，作為優(yōu)選，重組表達(dá)菌株為酵母菌株BY4742-SgCS-50K。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備所述重組表達(dá)菌株的方法，所述方法是在野生型羅漢果葫蘆二烯醇合酶基因序列的基礎(chǔ)上，將其編碼的第50位精氨酸突變成賴氨酸K，得到突變基因型，將突變基因型連到表達(dá)載體得到重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主菌中即得到重組菌株。所述方法具體包括以下步驟:

(1)以含有SEQIDNO.3所示核酸序列的質(zhì)粒為模板，以50K-F和50K-R所示的核酸序列為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即得到大量含有編碼的50位精氨酸突變成賴氨酸K的突變體基因序列的重組質(zhì)粒；特別地，所述SEQIDNO.3所示核酸序列即為羅漢果葫蘆二烯醇合酶野生型基因；優(yōu)選地，所述質(zhì)粒為pCEV-G4-Km質(zhì)粒；

(2)將上一步得到的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中；

(3)提取E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入到表達(dá)菌株，獲得重組表達(dá)菌株。