[發明專利]一種產蘋果酸基因工程菌及其生產蘋果酸的方法

有效

• 申請號: 201910094815.3
• 申請日: 2019-01-31
• 公開（公告）號: CN109797111B
• 公開（公告）日: 2023-08-29
• 發明（設計）人: 唐曦;李有發;王家鳳;栗元龍;康小玲
• 申請（專利權）人: 上海東庚化工技術有限公司
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/31;C12N9/10;C12N15/54;C12P7/46;C12R1/645;C12R1/685;C12R1/69;C12R1/66
• 代理公司: 上海光華專利事務所(普通合伙) 31219
• 代理人: 周建軍

本發明提供一種產蘋果酸基因工程菌及其生產蘋果酸的方法，包括提高受體菌中二元酸轉運蛋白的表達或活性，降低受體菌中甲基轉移酶laeA的表達或活性，獲得產蘋果酸的工程菌。本發明有效提高蘋果酸的產量，進一步地，通過引入耐酸工程菌，還有效避免中和劑的使用。

技術領域

本發明涉及基因工程和生物技術領域，特別是涉及一種通過基因工程手段構建蘋果酸生產菌株和提高蘋果酸產量的方法及應用，同時還進一步涉及耐酸的高產蘋果酸生產菌株的構建及應用。

背景技術

生物法生產大宗化學品是我國經濟綠色可持續發展、擺脫石油依賴的有效途徑之一。蘋果酸是非常重要的大宗化工產品，早在2004年就被美國能源部認定為最具競爭力的12種平臺化合物之一，其被廣泛用于食品、飲料、香料、醫藥保健、化工、塑料等行業。目前，國際市場需求量保持快速增長，市場前景廣闊，實現發酵法生產蘋果酸對我國建立化學品生物制造產業體系具有重要意義。

目前，合成蘋果酸的相關研究主要集中在絲狀真菌上。早在上世紀60年代，就有利用絲狀真菌黃曲霉合成蘋果酸的報道。然而，由于黃曲霉毒素的原因，利用黃曲霉發酵生產蘋果酸未能得到大規模工業生產。近年來，有報道表明在米曲霉A.oryzae?NRRL?3488過表達自身的丙酮酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶及C4-二羧酸轉運蛋白后，其蘋果酸產量得到了極大的提高，以葡萄糖為碳源時，在164小時內蘋果酸產量達到了154g/L，產率為0.94g/L/h，轉化率達到理論值的69％。國內江南大學對米曲霉蘋果酸合成途徑進行了系統代謝工程改造，蘋果酸產量達到93.2g/L，生產效率為1.38g/L/h。在蘋果酸合成過程中，中和劑碳酸鈣與蘋果酸反應，將培養基的pH保持在中性左右，利于微生物發酵生長，但會增加發酵成本，同時形成的蘋果酸鈣在后期的分離純化中需要用到大量強酸，不僅增加了成本，還對環境造成了極大的危害。因此，開發耐酸的蘋果酸生產菌株是解決這一問題的有效途徑。

曲霉被廣泛的應用在蛋白、化學品的工業化生產過程中，尤其是黑曲霉，它是多種蛋白和有機酸的生產菌株。黑曲霉在深層次發酵過程中具有極其顯著的特點，在快速生長期時，其可以分泌大量有機酸(草酸、檸檬酸等)，使得發酵培養基的pH低于2。黑曲霉的這種發酵特性，不僅大大降低發酵過程中染菌的風險，還可以省去生產有機酸過程中中和有機酸所使用的大量碳酸鹽，對環境友好。然而，目前黑曲霉主要還是集中在檸檬酸的生產上，并沒有涉及蘋果酸的生產。

發明內容

鑒于以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種產蘋果酸基因工程菌及其生產蘋果酸的方法，用于提高蘋果酸產量，在此基礎上進一步提高工程菌的耐酸性，避免中和劑的使用。

為實現上述目的及其他相關目的，本發明提供一種構建產蘋果酸的工程菌的方法，包括提高受體菌中二元酸轉運蛋白的表達或活性，降低所述受體菌中甲基轉移酶laeA的表達或活性，獲得產蘋果酸的工程菌。

可選地，所述二元酸轉運蛋白的氨基酸序列包括如SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列或保有功能的隨機和/或定點誘變序列。

可選地，提高上述受體菌中二元酸轉運蛋白的表達或活性是通過向受體菌中導入二元酸轉運蛋白的編碼基因來實現的。

可選地，所述二元酸轉運蛋白的編碼基因的核苷酸序列包括如SEQ?ID?NO.2所示的片段或保有功能的隨機和/或定點誘變序列。

可選地，所述甲基轉移酶laeA的氨基酸序列包括如SEQ?ID?NO.3所示的氨基酸序列或保有功能的隨機和/或定點誘變序列。

可選地，降低所述受體菌中甲基轉移酶laeA的表達或活性是通過敲除或沉默所述受體菌中甲基轉移酶laeA的編碼基因來實現。

可選地，所述甲基轉移酶laeA的編碼基因的核苷酸序列包括如SEQ?ID?NO.4所示的片段或保有功能的隨機和/或定點誘變序列。