[發明專利]一種產蘋果酸基因工程菌及其生產蘋果酸的方法

有效

• 申請號: 201910094815.3
• 申請日: 2019-01-31
• 公開（公告）號: CN109797111B
• 公開（公告）日: 2023-08-29
• 發明（設計）人: 唐曦;李有發;王家鳳;栗元龍;康小玲
• 申請（專利權）人: 上海東庚化工技術有限公司
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/31;C12N9/10;C12N15/54;C12P7/46;C12R1/645;C12R1/685;C12R1/69;C12R1/66
• 代理公司: 上海光華專利事務所(普通合伙) 31219
• 代理人: 周建軍

1.一種構建產蘋果酸的工程菌的方法，其特征在于：包括提高受體菌中二元酸轉運蛋白的表達或活性，降低所述受體菌中甲基轉移酶laeA的表達或活性，獲得產蘋果酸的工程菌；

所述甲基轉移酶laeA的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.3所示；

降低受體菌中所述甲基轉移酶laeA的表達或活性是通過敲除或沉默所述甲基轉移酶laeA的編碼基因來實現；

所述受體菌選自嗜熱毀絲霉、黑曲霉中的至少一種；

所述二元酸轉運蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：提高所述受體菌中二元酸轉運蛋白的表達或活性是通過向受體菌中導入二元酸轉運蛋白的編碼基因來實現的。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述二元酸轉運蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：通過同源重組法、原生質體法、農桿菌介導法、RNAi沉默法或CRISPR法降低所述甲基轉移酶laeA的表達或活性。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述受體菌選自嗜熱毀絲霉時，采用同源重組法敲除所述甲基轉移酶laeA的編碼基因，進行敲除時，上游同源重組片段的核苷酸序列包括如SEQ?ID?NO.5所示片段，下游同源重組片段的核苷酸序列包括如SEQ?ID?NO.6所示片段。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述受體菌選自黑曲霉時，采用同源重組法敲除所述甲基轉移酶laeA的編碼基因。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于：進行敲除時，上游同源重組片段的核苷酸序列包括如SEQ?ID?NO.7所示片段，下游同源重組片段的核苷酸序列包括如SEQ?ID?NO.8所示片段。

8.根據權利要求1-7任意一項所述方法制得的用于生產蘋果酸的工程菌。

9.根據權利要求8所述工程菌在蘋果酸生產中的應用。

10.一種生產蘋果酸的方法，包括：培養權利要求8所述工程菌，收集孢子，將所述孢子接種至發酵培養基中，收集發酵產物，從中獲得蘋果酸，所述發酵培養基包括如下組分：100g/L葡萄糖，6.0g/L蛋白胨，150mg/L磷酸二氫鉀，150mg/L磷酸氫二鉀，100mg/L氯化鈣，100mg/L硫酸鎂，碳酸鈣80.0g/L，1mg/L生物素，1mL/L微量元素，余量為水；其中，所述微量元素包括如下組分：氯化鈉5g/L，硫酸亞鐵5g/L，檸檬酸1g/L，余量為水。