[發明專利]一種三分子熒光互補蛋白質作用感受器表達系統及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201910093006.0
• 申請日: 2019-01-30
• 公開（公告）號: CN109735569B
• 公開（公告）日: 2023-03-28
• 發明（設計）人: 李學義;彭曉欣;王曉龍
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;G01N33/68
• 代理公司: 上海光華專利事務所(普通合伙) 31219
• 代理人: 許亦琳;余明偉

本發明提供了一種三分子熒光互補蛋白質作用感受器表達系統，所述表達系統至少包括：第一目標基因元件?第二目標基因元件?監測器元件，所述第一目標基因元件用于表達第一目標基因，所述第一目標基因元件包括GFP?11?第一目標序列，所述第二目標基因元件用于表達第二目標基因，所述第二目標基因元件包括GFP?10?第二目標序列，所述監測器元件用于將第一目標基因和第二目標基因在同一驅動子控制下表達，所述監測器元件包括IRES?GFP?1?9，所述GFP?11、GFP?10和GFP?1?9可分別拆分自GFP。本發明所述的表達系統適用于多種細胞且轉染效率較高，適用于研究較難用大的GFP片段標記的、不穩定蛋白復合物內的相互作用。

技術領域

本發明涉及一種生物技術領域，特別是涉及一種三分子熒光互補蛋白質作用感受器表達系統及其制備方法與應用。

背景技術

在細胞的生命活動中，絕大部分蛋白質都是通過與其它蛋白質發生作用來行使其功能，蛋白質-蛋白質相互作用常被用于疾病治療措施研發的主要靶標。蛋白片段互補分析技術，(protein-fragment complementation assay,PCA)是一種對蛋白質-蛋白質相互作用進行定性與定量研究的有效方法。在PCA中，報告蛋白質被拆分為兩段分別與待檢測的相互作用的蛋白質融合，當待檢測的蛋白質相互作用發生后，報告蛋白質的兩個片段重新組合成功能性的報告蛋白質，從報告蛋白質拆分的兩個片段間本身隨機發生重組的幾率較低，只有當與它們相融合的兩個蛋白質發生作用后，才能縮短二者重組所需的空間距離而促進重組。任何能被分割為兩部分并以非共價的方式重組和恢復其功能的蛋白質都可用作PCA系統的報告蛋白，如如二氫葉酸還原酶、β-內酰胺酶、熒光蛋白質等蛋白質。

綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)是一種在生物醫學研究中被廣泛應用的報告蛋白質。2000年，Ghosh等發現GFP可以被分為N端與C端兩個片段，兩段重新組合后可以再次形成功能性的GFP蛋白，因此GFP可以應用于雙分子熒光互補技術(bimolecular fluorescence complementation，BiFC)。但是BiFC(也包括其它二片段互補系統)存在假陽性率高、影響待測相互作用的蛋白質的折疊、定位和功能等諸多弊端，以致后來在此基礎上發展出三分子熒光互補技術(tripartite fluorescencecomplementation，TriFC)。目前的TriFC體系(圖1)將GFP的三個片段構建在不同的表達載體中，重組效率低，且多用于非哺乳類細胞。

發明內容

鑒于以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種三分子熒光互補蛋白質作用感受器表達系統及其制備方法與應用，用于解決現有技術中三分子熒光互補表達系統重組效率低的問題。

為實現上述目的及其他相關目的，本發明第一方面提供一種三分子熒光互補蛋白質作用感受器表達系統，所述表達系統至少包括：第一目標基因元件-第二目標基因元件-監測器元件，所述第一目標基因元件用于表達第一目標基因，所述第一目標基因元件包括GFPβ11-第一目標序列，所述第二目標基因元件用于表達第二目標基因，所述第二目標基因元件包括GFPβ10-第二目標序列，所述監測器元件用于將第一目標基因和第二目標基因在同一驅動子控制下表達，所述監測器元件包括IRES-GFPβ1-9，所述GFPβ11、GFPβ10和GFPβ1-9可分別拆分自GFP。

在一種實施方式中，所述GFPβ11的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述GFPβ10的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述GFPβ1-9的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

在一種實施方式中，所述IRES的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本發明第二方面提供前述三分子熒光互補蛋白質作用感受器表達系統的制備方法，至少包括如下步驟：

1)采用基因合成的方式合成第一目標基因元件-第二目標基因元件；

2)構建監測器元件表達載體；