[發明專利]中華鱉ZW性染色體型微創快速鑒定PCR引物組、位點、方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201910091887.2
• 申請日: 2019-01-30
• 公開（公告）號: CN109652563B
• 公開（公告）日: 2019-10-18
• 發明（設計）人: 許曉軍;張海琪;朱凝瑜;孟慶輝
• 申請（專利權）人: 浙江省水產技術推廣總站
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6879;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 杭州君度專利代理事務所(特殊普通合伙) 33240
• 代理人: 朱亞冠

本發明公開中華鱉ZW性染色體型微創快速鑒定PCR引物組、位點、方法及試劑盒。該引物組序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。本發明可以微量(0.5?1uL)中華鱉血液為起始模板，利用前述引物組進行PCR擴增，擴增產物進行電泳檢測，當擴增產物出現2031bp大小條帶時，中華鱉為ZZ性染色體型；當擴增產物出現2031bp和1624bp大小的條帶時，則中華鱉為ZW性染色體型。本發明以微創采集的微量血液為起始材料，快速檢測中華鱉性染色體型，并且檢測對受檢個體損傷極小，可以確保各生長發育階段的中華鱉取樣后均可健康存活，為中華鱉單性養殖技術與性控育種中性染色體型鑒定提供重要工具。

技術領域

本發明屬于分子生物學鑒定技術領域，涉及中華鱉ZZ/ZW性染色體型鑒定領域，特別涉及一種可以省去基因組提取操作的微創快速鑒定中華鱉性染色體型的PCR擴增引物組、位點、方法及試劑盒。

背景技術

中華鱉(Pelodiscus sinensis)隸屬于爬行綱龜鱉目鱉科鱉屬，俗稱甲魚、團魚、王八等，其在我國分布于除新疆、西藏和青海以外的各個省份。目前，中華鱉養殖業已經發展成為了大規模、有影響的特種水產養殖產業，2017年中華鱉全國總產量達32.21萬噸，居世界首位。

中華鱉作為我國重要的名貴水產品之一，其養殖生產性能存在顯著的性別二態性，雄鱉生長速度較雌鱉快25％-30％。國內外市場對商品中華鱉存在性別偏好，國內市場偏愛雄鱉，雄鱉價格較雌鱉高20％左右；日本出口市場偏好雌鱉，通常要求商品鱉雌雄配比為4：1。因此，中華鱉產業對單性養殖和性控育種有強烈需求，但依靠現有的技術手段尚無法實現。首先，就單性養殖而言，核心問題在于如何在早期準確鑒定稚鱉性別。因為中華鱉養殖周期長，生態養殖情況下需要1冬齡才能通過外觀進行鑒別。如可以在初孵稚鱉期就準確鑒定性別，即可在稚鱉期實現單性分塘養殖，可降低成本、提高效益。另外，采用性控育種技術實現中華鱉全雄育苗，需要采取偽雌親本(即生理雌性，性染色體ZZ型)與雄性親本(即生理雄性，性染色體型ZZ型)的技術路線，其核心技術之一就是如何鑒別性染色體型為ZZ的偽雌個體。盡可能越早、越準確地鑒別出偽雌個體，才可以使該技術路線具有實際可操作性。

目前，ZW性染色體型鑒別的方法有性染色體Z/W形態差異觀察鑒定(王偉；錢國英；李彩燕等.2014)、性染色體Z/W基因組差異熒光原位雜交鑒定(Badenhorst,D；Stanyon,R；Engstrom,T et al.2013)。然而這些方法操作繁瑣，且需犧牲待檢個體或對待檢個體造成嚴重創傷，因此不符合實際應用要求。

因此，開發出早期微創ZW性染色體鑒定技術，對中華鱉單性養殖技術和性控育種技術的實現，對中華鱉產業健康可持續發展具有重要推動作用。

發明內容

本發明的第一個目的是針對現有技術的不足，提供一種快速鑒定中華鱉ZW性染色體型的PCR引物組，且僅需一對引物即可實現ZW性染色體型區分鑒別。

本發明的第二個目的是提供一種快速鑒定中華鱉ZW性染色體型的PCR方法，且該方法較常規PCR方法具有以下2個明顯優點：一是該PCR方法無需上游基因組提取步驟，節省時間、試劑耗材成本；二是該PCR方法樣本可以從初孵稚鱉至成鱉期采用無創或微創法獲得。檢測只需采集微量血液(微升級)即可滿足檢測樣品需求，且省去基因組提取步驟，直接將微量全血(0.5-1μL)加入PCR體系即可。既節省基因組提取的時間、經濟成本，又可將對待檢中華鱉損傷降到最低，保證各生長發育階段中華鱉性染色體型檢測后的樣本存活，創傷最低。

本發明的第三個目的是提供一種快速鑒定中華鱉ZW性染色體型的試劑盒。

本發明的上述第四個目的是提供一種用于鑒定中華鱉ZW性染色體型的位點。

本發明的上述第一個目的是通過以下技術方案實現：一種快速鑒定中華鱉ZW性染色體型的PCR引物組，該引物組序列如下：

ZW性染色體型鑒別正向引物序列為：