[發明專利]一種基于CRISPR/Cas和lambda Red重組系統的體內質粒編輯系統及其應用

在審

• 申請號: 201910089302.3
• 申請日: 2019-01-30
• 公開（公告）號: CN109706109A
• 公開（公告）日: 2019-05-03
• 發明（設計）人: 孫義成;耿藝漫;嚴海芹;任改仙;郭曉鵬;錢朝暉;趙振東;金奇
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院病原生物學研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/90;C12N15/65;C12N15/113;C40B50/06;C12R1/19
• 代理公司: 北京萬象新悅知識產權代理有限公司 11360
• 代理人: 李稚婷

本發明公布了一種基于CRISPR/Cas和lambda Red重組系統的體內質粒編輯系統及其應用。所述體內質粒編輯系統包括：HsdR功能缺失且基因組中整合有可誘導表達的λRed重組蛋白基因和可誘導表達的Cas蛋白基因的大腸桿菌工程菌株，插入靶標序列的crRNA表達質粒，以及等位交換底物和靶標質粒。本發明將CRISPR?Cas系統與重組工程整合使用，建立一種快速且無痕的體內質粒編輯方法，可方便快捷地在大腸桿菌中對質粒進行基因刪除、點突變和片段插入，以及建立質粒突變庫。

技術領域

本發明涉及質粒編輯系統，特別涉及一種用于體內改造質粒的CRISPR/Cas和λRed重組系統。

背景技術

重組工程是一種基于核酸同源重組原理的生物技術，利用噬菌體重組蛋白來促進由單鏈DNA(ssDNA)或線性化雙鏈DNA(dsDNA)介導的體內同源重組。目前，已被廣泛應用于多種原核生物的基因組DNA、BAC以及質粒DNA的改造，包括突變、刪除或者插入。但是，該技術存在重組效率較低的問題，需要添加篩選標記(如抗生素)來篩選重組子，而后去掉篩選標記則需利用兩步法或引入序列特異性重組酶切除抗性標簽(抗性基因兩邊有同向的兩個短的DNA序列可以被特定的重組酶識別)，切除后仍會留下一個短的能夠被重組酶識別的DNA序列。這使重組操作更復雜且耗時長，很難得到一個真正的無痕突變株。為解決重組效率低以及實現無痕改造細菌基因組DNA，重組工程偶聯CRISPR-Cas系統是一種簡單有效的方式。

RNA引導的CRISPR-Cas核酸內切酶系統，作為原核生物的一種獲得性免疫系統，當前已成為一種高效的基因編輯工具。Cas12a(亦稱為Cpf1)，屬于II類V型CRISPR系統內切酶，是一種雙重核酸酶，可切割RNA使之形成成熟的向導crRNA，亦可識別PAM區(5’-YTN-3’)并在crRNA引導下切割靶向DNA。CRISPR-Cas12a系統被廣泛應用于對細菌、植物以及哺乳動物等諸多物種進行基因編輯。我們已利用CRISPR系統偶聯λRed重組系統在大腸桿菌、鼠疫桿菌以及分枝桿菌中實現基因編輯操作。

質粒，作為一種非常有用的工具，常用于研究細胞基因組信息以及表達異源基因和信號通路基因。隨著分子生物學技術日益發展，已有許多方法可用于體外、體內質?？寺?，甚至大片段克隆也不再是難題。但是，對大質粒進行遺傳操作，比如點突變、刪除、替換以及插入，仍很困難?；谥亟M工程的質粒編輯技術可以有效地解決上述問題。該方法可對質粒進行定點精準改造，勿需考慮是否存在限制性內切酶位點。但是，由于重組效率低下，常利用篩選標記或反向篩選元件來篩選重組子。而且，多聚體質粒的形成以及同一細胞內重組質粒和原始質粒的并存問題也限制該方法的應用。

發明內容

針對傳統同源重組系統構建質粒過程中存在的上述問題，本發明旨在建立一種高效的體內質粒編輯系統和方法，可方便快捷地實現刪除、點突變、替換及片段插入，并能夠應用于突變文庫的建立。

為實現本發明目的，本發明首先提供一種用于質粒編輯的大腸桿菌工程菌株，所述工程菌株HsdR功能缺失，且在其基因組中整合有可誘導表達的λRed重組蛋白基因和可誘導表達的Cas蛋白基因。

在本發明的一個實施例中，提供了一種上述大腸桿菌工程菌株SY4539，其構建如圖1所示，通過同源重組方法將阿拉伯糖啟動子及其調控的基因Cas12a整合至大腸桿菌DY331基因組，進一步利用基因敲除方法in-frame刪除hsdR。

上述λRed重組蛋白含Gam、Beta和Exo蛋白，這三個蛋白共同介導雙鏈DNA等位交換底物的同源重組，其中Beta蛋白介導單鏈DNA等位交換底物的同源重組。優選的，上述λRed重組蛋白可由溫度敏感啟動子驅動表達。

所述Cas蛋白，可為Cas9、Cas12a等，例如在本發明實施例中為Cas12a。優選的，所述Cas蛋白可以在阿拉伯糖啟動子的驅動下進行表達。

HsdR的功能缺失導致菌株細胞內的I型限制酶EcoK活性缺失，以利于外源DNA導入及質粒轉化。