[發(fā)明專利]一種基于CRISPR/Cas和lambda Red重組系統(tǒng)的體內(nèi)質(zhì)粒編輯系統(tǒng)及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910089302.3
• 申請日: 2019-01-30
• 公開（公告）號: CN109706109A
• 公開（公告）日: 2019-05-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫義成;耿藝漫;嚴(yán)海芹;任改仙;郭曉鵬;錢朝暉;趙振東;金奇
• 申請（專利權(quán)）人: 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/90;C12N15/65;C12N15/113;C40B50/06;C12R1/19
• 代理公司: 北京萬象新悅知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11360
• 代理人: 李稚婷

1.一種體內(nèi)質(zhì)粒編輯系統(tǒng)，對靶標(biāo)質(zhì)粒進(jìn)行體內(nèi)基因編輯，其包括大腸桿菌工程菌株、pAC-crRNA質(zhì)粒、等位交換底物和靶標(biāo)質(zhì)粒，其中：所述大腸桿菌工程菌株HsdR功能缺失，且在其基因組中整合有可誘導(dǎo)表達(dá)的λRed重組蛋白基因和可誘導(dǎo)表達(dá)的Cas蛋白基因；所述pAC-crRNA質(zhì)粒含有組成型啟動子驅(qū)動的直接重復(fù)序列-間隔序列-直接重復(fù)序列單元，其中所述間隔序列包含靶標(biāo)序列連入位點；所述等位交換底物為單鏈DNA或線性雙鏈DNA。

2.如權(quán)利要求1所述的體內(nèi)質(zhì)粒編輯系統(tǒng)，其特征在于，所述大腸桿菌工程菌株的基因組中整合的Cas蛋白基因是Cas9或Cas12a的基因，由阿拉伯糖啟動子驅(qū)動表達(dá)；所述λRed重組蛋白基因由溫度敏感啟動子驅(qū)動表達(dá)。

3.如權(quán)利要求1所述的體內(nèi)質(zhì)粒編輯系統(tǒng)，其特征在于，所述pAC-crRNA質(zhì)粒上的間隔序列包含靶標(biāo)序列連入位點，所述靶標(biāo)序列連入位點是包含兩個或更多個限制性內(nèi)切酶酶切位點的多克隆位點。

4.如權(quán)利要求1所述的體內(nèi)質(zhì)粒編輯系統(tǒng)，其特征在于，所述Cas蛋白基因為Cas12a的基因，所述pAC-crRNA質(zhì)粒上的直接重復(fù)序列如序列表中SEQ ID No：28所示。

5.如權(quán)利要求1所述的體內(nèi)質(zhì)粒編輯系統(tǒng)，其特征在于，所述pAC-crRNA質(zhì)粒含有與靶標(biāo)質(zhì)粒上的選擇標(biāo)記基因不同的選擇標(biāo)記基因。

6.如權(quán)利要求1所述的體內(nèi)質(zhì)粒編輯系統(tǒng)，其特征在于，所述pAC-crRNA質(zhì)粒上含有負(fù)選擇標(biāo)記基因。

7.如權(quán)利要求1所述的體內(nèi)質(zhì)粒編輯系統(tǒng)，其特征在于，作為等位交換底物的單鏈DNA是針對靶標(biāo)序列的靶向前導(dǎo)鏈的單鏈DNA寡核苷酸，或者是針對靶標(biāo)序列的靶向后隨鏈的單鏈DNA寡核苷酸；作為等位交換底物的線性雙鏈DNA，其上下游具有同源臂片段，所述同源臂片段≥30bp。

8.利用權(quán)利要求1～7任一所述的體內(nèi)質(zhì)粒編輯系統(tǒng)在菌株中進(jìn)行質(zhì)粒編輯的方法，包括以下步驟：

1)構(gòu)建crRNA表達(dá)質(zhì)粒：在pAC-crRNA質(zhì)粒的間隔序列中連入靶標(biāo)序列，所述靶標(biāo)序列是針對靶標(biāo)質(zhì)粒的靶標(biāo)基因編輯位點的DNA序列；

2)制備針對靶標(biāo)質(zhì)粒的靶標(biāo)基因的等位交換底物；

3)制備所述大腸桿菌工程菌株的感受態(tài)細(xì)胞，將靶標(biāo)質(zhì)粒、crRNA表達(dá)質(zhì)粒和等位交換底物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中；

4)篩選出重組陽性克隆；

5)通過負(fù)篩法使crRNA表達(dá)質(zhì)粒丟失，得到被編輯的靶標(biāo)質(zhì)粒最終克隆。

9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，步驟1)具體包括：

1-1)針對需要編輯的靶標(biāo)基因，根據(jù)靶標(biāo)基因內(nèi)部的PAM區(qū)選擇位于PAM區(qū)3’端末尾的18～30bp作為靶標(biāo)序列，設(shè)計并合成正向和反向的寡核苷酸；

1-2)將合成的正向和反向的寡核苷酸磷酸化后退火，得到退火產(chǎn)物；

1-3)將退火產(chǎn)物連入酶切后的pAC-crRNA載體中，并轉(zhuǎn)化宿主菌，經(jīng)PCR和測序驗證后得到crRNA表達(dá)質(zhì)粒。

10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，步驟3)通過電轉(zhuǎn)化法或化學(xué)轉(zhuǎn)化法將靶標(biāo)質(zhì)粒、crRNA表達(dá)質(zhì)粒和等位交換底物導(dǎo)入大腸桿菌工程菌株中；步驟5)采用SacB負(fù)篩法。

11.一種建立質(zhì)粒突變庫的方法，基于目的片段設(shè)計隨機(jī)引物，根據(jù)權(quán)利要求1～8所述的方法進(jìn)行質(zhì)粒編輯，得到質(zhì)粒突變庫。