[發明專利]一種補料分批發酵枯草芽孢桿菌制備褐藻膠裂解酶的方法

在審

• 申請號: 201910088991.6
• 申請日: 2019-01-30
• 公開（公告）號: CN110257360A
• 公開（公告）日: 2019-09-20
• 發明（設計）人: 胡永紅;王煜洲;楊文革;周俊;曹洋;馬小平
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N1/20;C12R1/125
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;袁正英

本發明公開了一種補料分批發酵枯草芽孢桿菌制備褐藻膠裂解酶的方法，該包括：活化菌種，補料分批發酵培養，菌體破碎，提取粗酶液。本方法工藝簡單，生產周期短，操作簡便，與傳統生產途徑相比，上述芽孢桿菌所產的褐藻膠降解酶酶活力高，發酵效率高。

技術領域

本發明涉及發酵工程領域，主要涉及的一種補料分批發酵枯草芽孢桿菌制備褐藻膠裂解酶的方法。

背景技術

褐藻膠是由-1，4-甘露糖醛酸(M)和-1，4-古洛糖醛酸(G)不規則鏈接起來的線性長鏈分子，其通過裂解反應可以得到功能性寡糖即為褐藻寡糖。目前研究表明，褐藻寡糖具有抗癌、抗凝、降脂、免疫調節和抗衰老、促進植物生長等明顯的功能性表現。因而得到了研究者的廣泛關注。

目前獲得褐藻膠寡糖的制備方法主要有物理降解、化學降解法和酶解法。物理降解主要通過紫外光照射、高溫等手段制備，有著成本需求高，產物成分難以控制等缺點，化學降解法主要通過制造酸性環境或者堿性環境使得海藻膠裂解，存在產物不均一、重復性差、對環境污染程度大等缺點，而酶解法因效率高、時間段、產物成分易控制等優勢成為近年來的主要研究方向。褐藻膠裂解酶主要存在于海洋細菌之中，如交替單胞菌(Alteromonas)，假交替單胞菌 (Pseudoalteromonas)，海洋弧菌(Vibrio)等。然而，這些微生物的安全性難以得到保證，如某些海洋弧菌可能會引起敗血癥，且大多數海洋細菌培養時需要添加海水，生產地域受到限制、因而限制了這一類微生物的應用。

發明內容

本發明的目的是針對上述問題，提供一種補料分批發酵枯草芽孢桿菌制備褐藻膠裂解酶的方法。

本發明的技術方案為：一種補料分批發酵枯草芽孢桿菌制備褐藻膠裂解酶的方法，其具體步驟如下：

(1)將枯草芽孢桿菌NJWGYHYH20130799接入液體培養基中活化，將活化好的菌種涂布于固體培養基中，長出菌落后挑選單菌落接入液體培養基中培養，得到種子液；

(2)補料分批發酵：將種子液接入發酵罐中發酵培養，發酵進行6～12h 時補料添加海藻酸鈉，使濃度在10～16h內保持在20～40g/L；發酵進行3～5h時，每隔10～20min補料添加葡萄糖，使其濃度保持在 2～4g/L；發酵進行到第10～12h時，改成每隔30min～40min添加葡萄糖，使其濃度控制在0.5～2g/L，發酵進行22～32h時停止補料添加；控制溫度、通氣量、轉速和pH值，發酵培養36～48h得發酵液；

(3)將上述發酵液在3～5℃下、經離心去除上清液后收集菌體，將收集的菌體進行破碎處理；隨后將破碎液在3～5℃下離心去除細胞碎片沉淀，收集上清液得到粗酶液。

上述步驟(1)中固體培養基為LB培養基；步驟(1)中活化和單菌落接入液體培養基的組分均為：海藻酸鈉20～40g/L，酵母膏4～8g/L，蛋白胨8～15g/L，NaCl 2～6g/L，pH為6.5～7.5；裝液量為容器體積的18～22％；活化和培養溫度均控制在35～38℃；搖床轉速均為 150～180r/min；培養16～24h后至對數中后期；活化時間為10～12h。

優選步驟(2)中種子液的接入量為發酵培養基體積分數比為 4～8％；發酵罐裝液量為發酵罐體積的25～45％。

優選步驟(2)中補料添加海藻酸鈉的濃度為50～80g/L；流加所用葡萄糖濃度為10～30g/L。