[發(fā)明專利]一種補料分批發(fā)酵枯草芽孢桿菌制備褐藻膠裂解酶的方法

在審

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• 申請日: 2019-01-30
• 公開（公告）號: CN110257360A
• 公開（公告）日: 2019-09-20
• 發(fā)明（設計）人: 胡永紅;王煜洲;楊文革;周俊;曹洋;馬小平
• 申請（專利權）人: 南京工業(yè)大學
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N1/20;C12R1/125
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;袁正英

本發(fā)明公開了一種補料分批發(fā)酵枯草芽孢桿菌制備褐藻膠裂解酶的方法，該包括：活化菌種，補料分批發(fā)酵培養(yǎng)，菌體破碎，提取粗酶液。本方法工藝簡單，生產(chǎn)周期短，操作簡便，與傳統(tǒng)生產(chǎn)途徑相比，上述芽孢桿菌所產(chǎn)的褐藻膠降解酶酶活力高，發(fā)酵效率高。

技術領域

本發(fā)明涉及發(fā)酵工程領域，主要涉及的一種補料分批發(fā)酵枯草芽孢桿菌制備褐藻膠裂解酶的方法。

背景技術

褐藻膠是由-1，4-甘露糖醛酸(M)和-1，4-古洛糖醛酸(G)不規(guī)則鏈接起來的線性長鏈分子，其通過裂解反應可以得到功能性寡糖即為褐藻寡糖。目前研究表明，褐藻寡糖具有抗癌、抗凝、降脂、免疫調(diào)節(jié)和抗衰老、促進植物生長等明顯的功能性表現(xiàn)。因而得到了研究者的廣泛關注。

目前獲得褐藻膠寡糖的制備方法主要有物理降解、化學降解法和酶解法。物理降解主要通過紫外光照射、高溫等手段制備，有著成本需求高，產(chǎn)物成分難以控制等缺點，化學降解法主要通過制造酸性環(huán)境或者堿性環(huán)境使得海藻膠裂解，存在產(chǎn)物不均一、重復性差、對環(huán)境污染程度大等缺點，而酶解法因效率高、時間段、產(chǎn)物成分易控制等優(yōu)勢成為近年來的主要研究方向。褐藻膠裂解酶主要存在于海洋細菌之中，如交替單胞菌(Alteromonas)，假交替單胞菌 (Pseudoalteromonas)，海洋弧菌(Vibrio)等。然而，這些微生物的安全性難以得到保證，如某些海洋弧菌可能會引起敗血癥，且大多數(shù)海洋細菌培養(yǎng)時需要添加海水，生產(chǎn)地域受到限制、因而限制了這一類微生物的應用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對上述問題，提供一種補料分批發(fā)酵枯草芽孢桿菌制備褐藻膠裂解酶的方法。

本發(fā)明的技術方案為：一種補料分批發(fā)酵枯草芽孢桿菌制備褐藻膠裂解酶的方法，其具體步驟如下：

(1)將枯草芽孢桿菌NJWGYHYH20130799接入液體培養(yǎng)基中活化，將活化好的菌種涂布于固體培養(yǎng)基中，長出菌落后挑選單菌落接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到種子液；

(2)補料分批發(fā)酵：將種子液接入發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵進行6～12h 時補料添加海藻酸鈉，使?jié)舛仍?0～16h內(nèi)保持在20～40g/L；發(fā)酵進行3～5h時，每隔10～20min補料添加葡萄糖，使其濃度保持在 2～4g/L；發(fā)酵進行到第10～12h時，改成每隔30min～40min添加葡萄糖，使其濃度控制在0.5～2g/L，發(fā)酵進行22～32h時停止補料添加；控制溫度、通氣量、轉速和pH值，發(fā)酵培養(yǎng)36～48h得發(fā)酵液；

(3)將上述發(fā)酵液在3～5℃下、經(jīng)離心去除上清液后收集菌體，將收集的菌體進行破碎處理；隨后將破碎液在3～5℃下離心去除細胞碎片沉淀，收集上清液得到粗酶液。

上述步驟(1)中固體培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基；步驟(1)中活化和單菌落接入液體培養(yǎng)基的組分均為：海藻酸鈉20～40g/L，酵母膏4～8g/L，蛋白胨8～15g/L，NaCl 2～6g/L，pH為6.5～7.5；裝液量為容器體積的18～22％；活化和培養(yǎng)溫度均控制在35～38℃；搖床轉速均為 150～180r/min；培養(yǎng)16～24h后至對數(shù)中后期；活化時間為10～12h。

優(yōu)選步驟(2)中種子液的接入量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積分數(shù)比為 4～8％；發(fā)酵罐裝液量為發(fā)酵罐體積的25～45％。

優(yōu)選步驟(2)中補料添加海藻酸鈉的濃度為50～80g/L；流加所用葡萄糖濃度為10～30g/L。