[發(fā)明專利]一種補(bǔ)料分批發(fā)酵枯草芽孢桿菌制備褐藻膠裂解酶的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910088991.6
• 申請日: 2019-01-30
• 公開（公告）號: CN110257360A
• 公開（公告）日: 2019-09-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡永紅;王煜洲;楊文革;周俊;曹洋;馬小平
• 申請（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N1/20;C12R1/125
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;袁正英

1.一種補(bǔ)料分批發(fā)酵枯草芽孢桿菌制備褐藻膠裂解酶的方法，其具體步驟如下：

(1)將枯草芽孢桿菌NJWGYHYH20130799接入液體培養(yǎng)基中活化，將活化好的菌種涂布于固體培養(yǎng)基中，長出菌落后挑選單菌落接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到種子液；

(2)補(bǔ)料分批發(fā)酵：將種子液接入發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵進(jìn)行6～12h時補(bǔ)料添加海藻酸鈉，使?jié)舛仍?0～16h內(nèi)保持在20～40g/L；發(fā)酵進(jìn)行3～5h時，每隔10～20min補(bǔ)料添加葡萄糖，使其濃度保持在2～4g/L；發(fā)酵進(jìn)行到第10～12h時，改成每隔30min～40min添加葡萄糖，使其濃度控制在0.5～2g/L，發(fā)酵進(jìn)行22～32h時停止補(bǔ)料添加；控制溫度、通氣量、轉(zhuǎn)速和pH值，發(fā)酵培養(yǎng)36～48h得發(fā)酵液；

(3)將上述發(fā)酵液在3～5℃下、經(jīng)離心去除上清液后收集菌體，將收集的菌體進(jìn)行破碎處理；隨后將破碎液在3～5℃下離心去除細(xì)胞碎片沉淀，收集上清液得到粗酶液。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(1)中固體培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基；液體培養(yǎng)基的組分為：海藻酸鈉20～40g/L，酵母膏4～8g/L，蛋白胨8～15g/L，NaCl 2～6g/L，pH為6.5～7.5；裝液量為容器體積的18～22％；培養(yǎng)溫度控制在35～38℃；搖床轉(zhuǎn)速150～180r/min；培養(yǎng)16～24h后至對數(shù)中后期。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(2)中種子液的接入量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積分?jǐn)?shù)比為4～8％；發(fā)酵罐裝液量為發(fā)酵罐體積的25～45％。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(2)中補(bǔ)料添加海藻酸鈉的濃度為50～80g/L；流加所用葡萄糖濃度為10～30g/L。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(2)中發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為：海藻酸鈉20～40g/L，酵母膏4～8g/L，蛋白胨8～15g/L，NaCl 2～6g/L，CaCO₃ 10～15g/L,K₂HPO₄ 0.8～1.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.8～1.2g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.015～0.025g/L，MnCl₂·4H₂O 0.001～0.005g/L，pH為6.5～7.5。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(2)中發(fā)酵的條件為：控制溫度在35～38℃，通氣量保持在3～5L/(L·min)，攪拌速率150～200r/min，pH值為6.5～7.5。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(3)中發(fā)酵液和破碎液的離心轉(zhuǎn)速均為10000～12000rpm/min，離心時間均為10～15min。