[發明專利]一種研磨與混合酶結合的提取臍帶間充質干細胞的方法

在審

• 申請號: 201910088003.8
• 申請日: 2019-01-29
• 公開（公告）號: CN109628394A
• 公開（公告）日: 2019-04-16
• 發明（設計）人: 高戎戎;馬林
• 申請（專利權）人: 勞敏翔
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 上海尚象專利代理有限公司 31335
• 代理人: 劉云

本發明公開了一種研磨與混合酶結合的提取臍帶間充質干細胞的方法，其包含：步驟1、將臍帶兩端去除，并清洗臍帶動靜脈中的血漬；步驟2、將臍動脈和臍靜脈剔除，將臍帶剪成小塊，剝離出來膠層，剪成更小的塊狀；步驟3、將組織塊分裝入離心管，用組織研磨機將組織研磨成肉糜；步驟4、用膠原蛋白酶和胰蛋白酶與肉糜懸液混合，置于搖床中震蕩；步驟5、再用培養基中和后，離心去上清，再與培養液混合，加入細胞培養瓶中；步驟6、靜置培養，然后用酶消化，再進行傳代培養；步驟7、繼續培養一段時間后，P1代再進行傳代培養，P2代凍存。本發明基于組織研磨法與消化結合的方法，能夠大大提高原代細胞得率，減少細胞損傷。

技術領域

本發明涉及一種用于哺乳動物細胞基因工程領域的提取方法，具體地，涉及一種能夠有效地研磨與混合酶結合的提取臍帶間充質干細胞的方法。

背景技術

臍帶間充質干細胞是存在于新生兒臍帶華通氏膠和血管周圍組織中的一種間充質干細胞。來源于臍帶的間充質干細胞因其取材方便，無道德倫理爭議，可獲取的細胞數量多、增殖能力強、免疫調節作用大，分泌細胞生長因子的總量也非常高，有利于皮膚組織損傷修復及皮膚過敏問題解決，基于此的藥妝產品開發研究不斷深入及干細胞產業逐漸大規模化和商業化。

具體而言，臍帶間充質干細胞培養大多使用貼壁法，將臍帶剪成小塊貼于培養皿表面，貼壁一周左右，代細胞爬出長滿后消化傳代，這一方法耗時較長通常需要一個月左右時間才能進行第一次傳代操作，其中最常見的問題是組織貼壁不牢，容易脫落，細胞爬出較少，原代培養時間過長使細胞老化，狀態變差，使用效果變差等；貼壁法工程量巨大，例如一根臍帶在P1代是細胞數量達10億，由于貼壁不完全，大大增加操作難度，由于爬出細胞分化程度和分裂不一，容易在后期造成細胞質地不均一，影響細胞的質控和使用；貼壁法造成生產成本問題是，原代培養時間較長，耗費培養液和血清較多，使成本大大增加。

通常的酶消化法，通常是采用膠原蛋白酶和胰蛋白酶結合消化臍帶的沃頓膠組織細胞進行培養，由于臍帶組織表面較濕滑，剪碎較困難，經常時間剪碎操作后，多數仍為肉眼可見的組織小塊，而胰蛋白酶是通過解離細胞間糖蛋白和黏蛋白來分離細胞的，消化過度容易對細胞造成損傷，損壞細胞膜，破壞細胞骨架影響細胞后續增殖和分化，酶作用于組織塊表面，經常導致表面組織細胞消化過度而組織內部細胞仍接觸不到消化液，導致消化法提取間充質干細胞得率低，細胞活性不佳，難以增殖到理想數目。

在需要大量制備臍帶間充質干細胞時，多采用消化的方式進行原代細胞的提取和制備，由于個體差異，消化酶對組織的浸潤及消化速率很難把控，組織表面消化過度會造成細胞大量損傷，原代獲取細胞量少，給細胞擴增增加難度，細胞擴增后狀態和活性變差，破壞細胞壁結構，影響細胞貼壁。

綜上所述，臍帶間充質干細胞大規模培養，原代使用貼壁法，貼壁不牢，培養時間較長，細胞狀態變老，爬出細胞狀態不均一，使用效果變差；且貼壁法工程量巨大，耗費較多的人力和物力，成產成本較高；臍帶間充質干細胞大量培養采用常規消化法，酶作用于組織塊表面，經常導致表面組織細胞消化過度而組織內部細胞仍接觸不到消化液，導致消化法提取間充質干細胞得率低，細胞活性不佳，細胞壁被破壞，貼壁程度低，細胞狀態差，難以增殖到理想數目，嚴重影響后期擴增與誘導或基因改造工作。

發明內容

本發明的目的是提供一種適于大規模培養臍帶間充質干細胞的原代提取方法，針對現有的臍帶間充質干細胞原代提取技術存在的諸多缺陷，基于組織研磨法與消化結合的方法，能夠大大提高原代細胞得率，減少細胞損傷。