[發(fā)明專利]一種研磨與混合酶結(jié)合的提取臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910088003.8
• 申請(qǐng)日: 2019-01-29
• 公開（公告）號(hào): CN109628394A
• 公開（公告）日: 2019-04-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高戎戎;馬林
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 勞敏翔
• 主分類號(hào): C12N5/0775
• 分類號(hào): C12N5/0775
• 代理公司: 上海尚象專利代理有限公司 31335
• 代理人: 劉云

1.一種研磨與混合酶結(jié)合的提取臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述的方法包含：

步驟1、將臍帶兩端去除，并清洗臍帶動(dòng)靜脈中的血漬；

步驟2、將臍動(dòng)脈和臍靜脈剔除，將臍帶剪成小塊，剝離出來(lái)膠層，剪成更小的塊狀；

步驟3、將組織塊分裝入離心管，用組織研磨機(jī)將組織研磨成肉糜；

步驟4、用膠原蛋白酶和胰蛋白酶與肉糜懸液混合，置于搖床中震蕩；

步驟5、再用培養(yǎng)基中和后，離心去上清，再與培養(yǎng)液混合，加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中；

步驟6、靜置培養(yǎng)，然后用酶消化，再進(jìn)行傳代培養(yǎng)；

步驟7、繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間后，P1代再進(jìn)行傳代培養(yǎng)，P2代凍存。

2.如權(quán)利要求1所述的研磨與混合酶結(jié)合的提取臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述的步驟1中，用含有慶大霉素和雙抗的生理鹽水清洗臍帶動(dòng)靜脈中的血漬。

3.如權(quán)利要求1所述的研磨與混合酶結(jié)合的提取臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述的步驟2中，將兩根臍動(dòng)脈和一根臍靜脈剔除，將臍帶剪成長(zhǎng)度為1cm的小塊，剝離出來(lái)膠層，剪成直徑為3mm的小塊。

4.如權(quán)利要求1所述的研磨與混合酶結(jié)合的提取臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述的步驟3中，將組織塊分裝入15ml離心管，每管內(nèi)的裝入體積為2ml，調(diào)節(jié)組織研磨機(jī)的轉(zhuǎn)速為800rpm，研磨1min，通過(guò)組織研磨機(jī)將組織研磨成肉糜。

5.如權(quán)利要求1所述的研磨與混合酶結(jié)合的提取臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述的步驟4中，用含有10mg/ml膠原蛋白酶的質(zhì)量百分比為0.125％的胰蛋白酶與肉糜懸液按體積比1:10混合，置于37℃的搖床中震蕩5min。

6.如權(quán)利要求1所述的研磨與混合酶結(jié)合的提取臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述的步驟5中，用培養(yǎng)基中和后，以1200rpm/min的轉(zhuǎn)速離心5min，去上清，再與培養(yǎng)液混合，所得的細(xì)胞懸液加入T225瓶中，每個(gè)T225瓶中加入50ml細(xì)胞懸液。

7.如權(quán)利要求6所述的研磨與混合酶結(jié)合的提取臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述的步驟5中，采用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中和后，離心去上清。

8.如權(quán)利要求6所述的研磨與混合酶結(jié)合的提取臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述的步驟5中，離心去上清后與培養(yǎng)液混合，所述的培養(yǎng)液為DMEM/F12加10％FBS的培養(yǎng)基。

9.如權(quán)利要求1所述的研磨與混合酶結(jié)合的提取臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述的步驟6中，靜置培養(yǎng)1周，待細(xì)胞爬出融合度為80％的時(shí)候，按質(zhì)量百分比計(jì)用含0.02％EDTA的0.25％的胰蛋白酶，進(jìn)行1傳6的消化傳代。

10.如權(quán)利要求1所述的研磨與混合酶結(jié)合的提取臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，所述的步驟7中，繼續(xù)培養(yǎng)5天后，P1代再進(jìn)行1傳6的傳代培養(yǎng)，P2代凍存。