[發明專利]一種產5α-雄烷二酮的基因工程菌及其應用

有效

• 申請號: 201910086805.5
• 申請日: 2019-01-29
• 公開（公告）號: CN111484961B
• 公開（公告）日: 2022-11-29
• 發明（設計）人: 王敏;申雁冰;趙云秋;駱健美;夏夢雷;馬賽
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N15/74;C12N15/66;C12P33/02;C12R1/32
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

本發明屬于生物催化技術領域，具體涉及直接從廉價底物植物甾醇(PS)為原料到5α?雄烷二酮(5α?AD)一步轉化的基因工程菌構建及其應用。本發明將來自梅毒螺旋體中的5α?還原酶基因異源表達到主產雄烯二酮(AD)的分枝桿菌中，實現從植物甾醇到5α?AD的一步生物轉化，從而實現5α?AD的綠色高效生產。

技術領域：

本發明屬于生物催化技術領域，具體涉及一種能夠直接從廉價底物植物甾醇(PS)到5α-雄烷二酮(5α-AD)一步轉化的基因工程菌及其應用。

背景技術：

甾體藥物作為一類在醫藥上占有重要地位的激素類藥物，目前已被鑒定的已經超過250多種，其市場需求僅次于抗生素，全球年產量超過100萬噸，具有非常廣闊的市場前景。甾體激素類藥物在抗腫瘤、抗炎癥、抗過敏等方面被廣泛應用，同時在治療風濕性關節炎、支氣管炎以及艾迪森等內分泌疾病也是必不可少的藥物。

5α-AD作為一種重要的甾體藥物中間體，被廣泛應用于合成美睪酮、雄諾龍、美替諾龍等甾體激素類藥物，具有廣泛的應用前景。目前5α-AD的現有合成途徑為化學合成法，但該方法存在合成起始底物價格高、反應步驟多、環境污染大、專一性差、過程不易控制等問題。隨著可持續發展理念的提出，開發一條綠色生物法生產重要甾體激素類藥物的新方法已經成為近期技術發展的重要方向。

近年來，隨著生物轉化與生物催化技術的發展，利用微生物轉化法發酵獲得重要甾體激素類藥物已經屢見不鮮。如利用分枝桿菌對PS進行側鏈降解來生產雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)；AD可以在簡單節桿菌的3-甾酮-△1-脫氫酶(ksdD)催化作用下生成雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)；AD又可以在赭曲霉的11α-羥化酶作用下生成11α-羥基-雄甾-4-烯-3,17-二酮(11α-OH-AD)。這些酶對底物的專一性作用是化學生產法所無法比擬的。

發明內容：

本發明針對現有化學法生產5α-AD的諸多問題，探索出一種綠色生物法生產5α-AD的新途徑。通過對5α-AD的合成路線進行重新設計，首先利用廉價的PS為原料經分枝桿菌側鏈降解作用生成AD，再經甾體5α-還原酶作用，將AD催化為5α-AD。因此本發明采用利用基因工程的手段，在主產AD的分枝桿菌中異源表達5α-還原酶，來實現從PS到5α-AD的一步生物轉化。

本發明實現上述目的的技術方案如下：一種產5α-AD的基因工程菌，是以主產AD的分枝桿菌為宿主細胞，異源表達5α-還原酶基因，從而獲得由PS到5α-AD的一步快速轉化的基因工程菌。

所述5α-還原酶基因是以齒垢密螺旋體中的5α-還原酶基因為原始基因，根據5α-還原酶基因在所述分枝桿菌內的表達密碼子偏好性，進行優化，獲得優化的5α-還原酶基因序列。

所述5α-還原酶基因原始核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

所述5α-還原酶基因優化后核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

優選地，所述分枝桿菌為快速生長型分枝桿菌，包括分枝桿菌(Mycobacteriumsp.)NRRLB-3683、分枝桿菌(Mycobacterium sp.)NRRLB-3805、恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatism)、偶發分枝桿菌(Mycobacterium fortuitum)、微黃分枝桿菌(Mycobacterium gilvum)、新金分枝桿菌(Mycobacterium neoaurum)、草分枝桿菌(Mycobacterium Phlei)、鳥分枝桿菌(Mycobacterium avium)。

更優選地，所述宿主細胞為新金分枝桿菌。

更優選地，所述新金分枝桿菌具體為新金分枝桿菌MNR M3△ksdD。