[發明專利]一種含完全植物來源的選擇報告基因表達框的載體構建方法及應用

在審

• 申請號: 201910085285.6
• 申請日: 2019-01-29
• 公開（公告）號: CN109735560A
• 公開（公告）日: 2019-05-10
• 發明（設計）人: 陳松;彭琦;浦惠明;張潔夫;胡茂龍;付三雄;高建芹;龍衛華;陳鋒;王曉東;張維;周曉嬰;熊冬琴
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/29;C12N15/66;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 程斯佳

本發明涉及一種含完全植物來源的選擇報告基因表達框的載體構建方法及應用，屬于生物技術領域。選擇報告基因的表達框分別由油菜基因組ALS基因啟動子和具有雙突變位點的抗ALS抑制類除草劑基因—mALS₃基因以及ALS基因的終止子序列構成。通過農桿菌介導法遺傳轉化煙草，在轉化過程中直接利用磺酰脲類除草劑綠磺隆做再生株的篩選劑，獲得轉基因煙草。經過PCR檢測和抗除草劑性鑒定，表明通過這一途徑獲得的轉基因煙草具有兼抗苯磺隆、雙氟磺酰胺和雙草醚等多種ALS抑制劑類除草劑的特性，因此，我們認為由油菜ALS基因啟動子、抗除草劑基因、和終止子序列構成的表達框可用做選擇報告基因表達框，該載體可以用于雙子葉植物的遺傳轉化。

一、技術領域

本發明涉及一種含完全植物來源的選擇報告基因表達框的載體構建方法及應用，屬于生物技術領域。

二、背景技術

轉基因生物技術源于上世紀的重組DNA技術的發明，1973年美國科學家發明了重組DNA技術，最初轉基因技術應用于醫藥領域，如一些重組疫苗、干擾素等均是轉基因產品。進入80年代，轉基因技術開始應用于農業育種領域，1983年美國首例轉基因植物(煙草和馬鈴薯)培育成功。自1996年始，轉基因作物在全球包括美國、巴西、阿根廷、中國、印度等28個國家商業化應用，至2015年已有26種轉基因作物(不包括康乃馨、玫瑰和矮牽牛)的363個轉化體獲準商業化種植或環境釋放，包括以抗除草劑和抗蟲為主的玉米、大豆、油菜及棉花等。從1996～2016年，全球轉基因作物商業化種植面積從170萬公頃增加到1.851億公頃，增長了110倍，農民收益超過了1500億美元。但隨著轉基因植物種類和種植面積的迅猛增加，轉基因植物中選擇標記基因的生物安全性已成為人們普遍關注的問題之一。

目前在植物遺傳轉化中廣泛應用的標記基因主要有2大類，一類是編碼可使抗生素失活的蛋白酶基因，包括新霉素磷酸轉移酶基因(nptⅡ)(Bevan et al.1983)、潮霉素磷酸轉移酶基因(hpt)(Ortiz et al.1996)等。抗生素類標記基因只是在植物遺傳轉化過程中起作用，一旦轉基因過程完成，抗生素類標記基因就失去其價值。

此外，抗生素類標記基因存在諸多安全性問題，主要包括環境和食品安全兩個方面，(1)可能會轉移到微生物中，使得病原菌獲得抗生素抗性，從而導致目前臨床使用的抗生素失效；(2)可能對人類與動物健康產生負面影響。從大量的試驗數據(Bennett etal.2004；Goldstein et al.2005；Ramessar et al.2007)以及多個權威機構和國際組織(NZ ERMA 2000；FAO/WHO 2000；OECD 2000；USA FDA 2001；CAC 2003a；EFSA 2007)發布的風險評估報告來看抗生素標記基因從轉基因植物轉移至土壤微生物或腸道微生物的風險性非常小，對環境或人類與動物的健康也并不產生危害，但人們還是希望通過一些新的技術手段或開發一些新的安全性標記基因來進一步提高轉基因植物的安全性。

在轉基因植物中提高其安全性的有效手段之一就是培育無選擇標記基因的轉基因植物，其中的有效策略是采取一系列措施在轉化植株篩選完成后將選擇標記基因去除。目前剔除轉基因植物選擇標記基因的方法主要有4種：共轉化法(Komari et al.1996；Luet al.2001)、轉座子系統(Cotsaftis et al.2002)、位點特異性重組酶系統(Woo etal.2009)和染色體內重組系統(Zubko et al.2000)。這些方法能完全消除對標記基因的質疑，有利于多基因轉化。但是，這些方法也存在耗時長、工作量大、轉化率低等缺點，而且受到植物繁殖方式的限制，還有待進一步研究探索。