[發明專利]一種含完全植物來源的選擇報告基因表達框的載體構建方法及應用

在審

• 申請號: 201910085285.6
• 申請日: 2019-01-29
• 公開（公告）號: CN109735560A
• 公開（公告）日: 2019-05-10
• 發明（設計）人: 陳松;彭琦;浦惠明;張潔夫;胡茂龍;付三雄;高建芹;龍衛華;陳鋒;王曉東;張維;周曉嬰;熊冬琴
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/29;C12N15/66;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 程斯佳

1.一種含完全植物來源的選擇報告基因表達框的載體的構建方法，其特征在于：完全采用甘藍型油菜基因組來源的抗ALS抑制劑類除草劑基因元件，構建選擇報告基因的表達框。

2.根據權利要求1所述的一種含完全植物來源的選擇報告基因表達框的載體構建方法，其特征在于：所述選擇報告基因的表達框的啟動子、選擇報告基因和終止子分別由油菜基因組ALS基因啟動子SEQ.ID.NO.1、具有雙突變位點的抗ALS抑制類除草劑基因mALS₃基因SEQ.ID.NO.2、以及ALS基因的終止子序列SEQ.ID.NO.3構成。

3.根據權利要求1或2所述的一種含完全植物來源的選擇報告基因的植物表達載體構建方法，其特征在于：

1)線性化載體：利用pCAMBIA0390載體序列，設計特異引物0390F(SEQ.ID.NO.4)5-’TGGCGGGATAA CCTAAGAG AAAAGAG-3’，0390R(SEQ.ID.NO.5)5’-CGTTAACACTAGTCAGATCTACCATGG-3’，通過PCR擴增線性化載體，在此過程中缺失掉原載體T-DNA區域內的nos polyA序列，膠回收純化6.4Kb的PCR產物，用于載體重組反應；

2)含雙突變位點的抗除草劑基因mALS₃的克?。阂陨暾執枮?01710166233.2的發明專利“基于體外定點突變獲得油菜抗多種ALS抑制劑類除草劑基因及應用”獲得的油菜抗除草劑基因peasy-mALS₃為模板，設計特異性擴增引物，并在上游引物的5’末端增加了同源重組序列，即下化線部分表示增加的堿基序列，以下同，與啟動子序列3’末端同源,引物對序列分別為ALSF(SEQ.ID.NO.6)5’-CTCTCTCCTCTAACCA TG GCGGCGGC AA CATCGTCTTCTC-3’和ALSR(SEQ.ID.NO.7)5'-TCAGTACTTAGTGC GACCAT CC-3'；應用北京全式金生物技術有限公司出品的高保真DNA聚合酶試劑盒擴增mALS₃基因序列；膠回收純化1.9Kb的PCR產物，用于載體重組反應；

3)油菜ALS基因啟動子序列克隆:以專利申請號：201710701957.2的發明專利“甘藍型油菜ALS基因啟動子及應用”獲得的油菜ALS基因啟動子序列為模板設計特異性引物，并在上游引物的5’末端引入與線性化載體左側末端同源的堿基序列，引物分別為：PrF(SEQ.ID.NO.8)5’-TGACTAGTGTTAACGGTGGAGCTGATCT TACCGACC GAAC-3’和PrR(SEQ.ID.NO.9)5’-GGTTAGAGGAGAGAGAGATGATGAA-3’，應用北京全式金生物技術有限公司出品的高保真DNA聚合酶試劑盒擴增ALS基因啟動子序列,膠回收純化1Kb的PCR產物，用于載體重組反應；

4)油菜ALS基因終止子序列克隆:設計引物序列分別為:AEF(SEQ.ID.NO.10)：5’-ATGGTCGCACTAAGTACTGAGAGATGAA GCTGG TGATCGATCATA-3’和390ER(SEQ.ID.NO.11)5’-TCTCTTAGGTTTACCCGCCATTATTGACACATACACAAA GTGTGA-3’，應用北京全式金生物技術有限公司出品的高保真DNA聚合酶試劑盒擴增ALS基因終止子序列,膠回收純化500bp的PCR產物，用于載體重組反應；

5)重組法植物表達載體構建：應用諾唯贊生物技術有限公司出品的重組克隆試劑盒Multis，將上述步驟1)、2)、3)和4)各步獲得的PCR產物通過重組酶反應構建目標載體，反應體系如下：5×CE Multis buffer 4μl，mALS₃ PCR產物2μl，ALS啟動子PCR產物2μl，ALS終止PCR產物2μl，Exnase^TM 2μl，線性化載體4μl,ddH₂O 2μl，于37℃下反應30min，后取5-10μl反應液通過熱激法轉化感受態大腸桿菌DH5α，在含有卡那霉素的LB培養基上，37℃培養過夜，挑取克隆進行PCR鑒定，再挑取PCR陽性克隆繼續液體培養，抽提質粒，用HindIII限制性內切酶進行酶切鑒定，重組后載體含有ALS基因序列，陽性克隆再進一步測序確定后，由此獲得的質粒定名為p0390-PdmAP即為含完全植物來源的選擇報告基因表達框的載體，并將目標載體p0390-PdmAP通過電擊法轉入農桿菌EHA105，PCR鑒定后將陽性克隆培養后于-80℃保存備用。