[發(fā)明專利]Nrf2/ARE在低氧時(shí)表達(dá)及與黃芪多糖保護(hù)作用測(cè)定方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910084960.3
• 申請(qǐng)日: 2019-01-29
• 公開（公告）號(hào): CN109797129A
• 公開（公告）日: 2019-05-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張甲翠;俞登虎;劉靜;李守璽;張新棟;焦克平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘭州大學(xué)第一醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071;C12Q1/02;C12Q1/686;G01N33/68;G01N33/573
• 代理公司: 重慶市信立達(dá)專利代理事務(wù)所(普通合伙) 50230
• 代理人: 包曉靜

本發(fā)明屬于Nrf2/ARE信號(hào)通路調(diào)控作用檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種Nrf2/ARE在低氧時(shí)表達(dá)及與黃芪多糖保護(hù)作用測(cè)定方法；釆用貼壁法培養(yǎng)HPAECs，建立HPAECs的缺氧模型，測(cè)定不同組間HPAECs上清液中Nrf2、SOD、GSH的濃度；RT?PCR檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞Nrf2mRNA、SODmRNA、GSH?PXmRNA的表達(dá)；免疫印跡法測(cè)定Nrf2、SOD、GSH?PX蛋白含量。本發(fā)明通過測(cè)定機(jī)體自身抗氧化應(yīng)激信號(hào)通路Nrf2/ARE在低氧時(shí)HPAECs的表達(dá)，推測(cè)Nrf2蛋白在肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)，而且黃芪多糖可以通過增強(qiáng)Nrf2蛋白的高表達(dá)發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，其作用效果具有時(shí)間和濃度依賴性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于Nrf2/ARE信號(hào)通路調(diào)控作用檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種Nrf2/ARE在低氧時(shí)表達(dá)及與黃芪多糖保護(hù)作用測(cè)定方法。

背景技術(shù)

目前，業(yè)內(nèi)常用的現(xiàn)有技術(shù)是這樣的：COPD是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見病、多發(fā)病，病死率高，給患者、社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，我國對(duì)7個(gè)地區(qū)20245名成年人進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果顯示40歲以上人群中COPD的患病率高達(dá)8.2％，世界銀行和世界衛(wèi)生組織資料表明，至2020年，COPD將位居世界疾病經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)第5位。Keapl/Nrf2-ARE信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的核心分子包括NF—E2相關(guān)因子-1(NF-E2-related factor 2，Nrf2)、Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Keap1)和抗氧化反應(yīng)元件(antioxident response element，ARE)，在細(xì)胞質(zhì)中Nrf2與Keap1結(jié)合，并通過Keap1蛋白將其錨定于由肌動(dòng)蛋白構(gòu)成的細(xì)胞骨架上，當(dāng)受到ROS等的刺激時(shí)，Keap1與Nrf2解偶聯(lián)使得Nrf2轉(zhuǎn)移入核，與基因中的Maf蛋白結(jié)合成異二聚體后識(shí)別ARE。國內(nèi)外多項(xiàng)研究表明Keapl/Nrf2-ARE信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、腫瘤系統(tǒng)自身抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，通過誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生II相解毒酶和抗氧化蛋白的高表達(dá)，拮抗組織的氧化損傷。萊菔硫烷可以活化Nrf2信號(hào)通路，上調(diào)其下游抗氧化物酶及醌氧化還原酶1(NQO－1)等酶的表達(dá)，減輕血腦脊液屏障氧化損傷。低劑量氧化劑激活細(xì)胞Nrf2，可以抵抗砷和次氯酸等化學(xué)試劑暴露所誘發(fā)的氧化應(yīng)激作用，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。高血糖誘導(dǎo)Nrf2-缺失小鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致腎功能障礙，經(jīng)激活Nrf2后可逆轉(zhuǎn)上述改變。而Nrf2基因敲除大鼠，即使血糖僅輕度升高也可在很短時(shí)間導(dǎo)致糖尿病心肌病發(fā)生，同樣通過激活Keapl/Nrf2-ARE通路，可阻止糖尿病心肌病進(jìn)程。目前認(rèn)為，Nrf2激活是細(xì)胞抗擊氧化應(yīng)激的關(guān)鍵步驟，但尚無研究表明參與COPD的氧化應(yīng)激反應(yīng)，在COPD合并肺動(dòng)脈高壓、肺心病的病理生理改變中，HPAECs的低氧性損傷發(fā)揮重要作用，而通過對(duì)Keap1/Nrf2/ARE通路的調(diào)控，可能成為預(yù)防和治療COPD合并癥的重要方法。

綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)存在的問題是：

(1)首次釆用貼壁法培養(yǎng)HPAECs，建立HPAECs的缺氧模型，測(cè)定不同組間HPAECs上清液中Nrf2、SOD、GSH-PX的濃度；

(2)首次采用RT-PCR檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞Nrf2mRNA、SODmRNA、GSH-PXmRNA的表達(dá)；

(3)免疫印跡法測(cè)定Nrf2、SOD、GSH-PX蛋白含量。

解決上述技術(shù)問題的難度和意義：本發(fā)明通過測(cè)定機(jī)體自身抗氧化應(yīng)激信號(hào)通路Nrf2/ARE在低氧時(shí)HPAECs的表達(dá)，推測(cè)Nrf2蛋白在肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)，而且黃芪多糖可以通過增強(qiáng)Nrf2蛋白的高表達(dá)發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，其作用效果具有時(shí)間和濃度依賴性，有效延COPD合并肺動(dòng)脈高壓、肺心病的病程。進(jìn)而通過對(duì)Nrf2/ARE信號(hào)通路在低氧時(shí)HPAECs表達(dá)的研究，探討其在COPD發(fā)生氧化應(yīng)激中的作用機(jī)制，為延緩COPD發(fā)生肺動(dòng)脈高壓、肺心病提供理論依據(jù)。本地區(qū)老年COPD發(fā)病率逐年上升，患者及社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)日益沉重，而黃芪多糖系傳統(tǒng)藥材，價(jià)格低廉，毒副作用少，若能發(fā)揮民族醫(yī)藥長(zhǎng)處，推廣其在這一領(lǐng)域的治療作用，積極為本地區(qū)COPD合并肺動(dòng)脈高壓、肺心病提供治療新思路，以期發(fā)揮本地區(qū)中藥治療特色，使患者受益，爭(zhēng)取最大社會(huì)效益。