[發明專利]Nrf2/ARE在低氧時表達及與黃芪多糖保護作用測定方法

在審

• 申請號: 201910084960.3
• 申請日: 2019-01-29
• 公開（公告）號: CN109797129A
• 公開（公告）日: 2019-05-24
• 發明（設計）人: 張甲翠;俞登虎;劉靜;李守璽;張新棟;焦克平
• 申請（專利權）人: 蘭州大學第一醫院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12Q1/02;C12Q1/686;G01N33/68;G01N33/573
• 代理公司: 重慶市信立達專利代理事務所(普通合伙) 50230
• 代理人: 包曉靜

1.一種Nrf2/ARE在低氧時表達及與黃芪多糖保護作用測定方法，其特征在于，所述Nrf2/ARE在低氧時表達及與黃芪多糖保護作用測定方法包括：

第一步，釆用貼壁法培養HPAECs，建立HPAECs的缺氧模型，測定不同組間HPAECs上清液中Nrf2、SOD、GSH-PX的濃度；

第二步，RT-PCR檢測內皮細胞Nrf2mRNA、SOD mRNA、GSH-PXmRNA、的表達；

第三步，免疫印跡法測定Nrf2、SOD、GSH-PX蛋白含量。

2.如權利要求1所述的Nrf2/ARE在低氧時表達及與黃芪多糖保護作用測定方法，其特征在于，所述第一步具體包括：

1)凍存HPAECs細胞的復蘇

①將液氮罐中取出細胞凍存管，迅速置于37℃水浴中，并輕輕搖動，使其快速融化；

②1000rpm離心5min，消毒后開啟，用槍頭吸去上清液；

③細胞沉淀用lml含10％新生牛血清的1640培養基重懸，細胞懸液移入25ml培養瓶，加培養液至總體積至5ml；

④置于37℃、5％CO₂、飽和濕度細胞培養箱中進行培養，24h后于倒置顯微鏡下觀察細胞是否貼壁生長，更換培養液；

2)細胞傳代

①貼壁生長的細胞2-3天更換培養液一次，細胞匯片達70-80％時可進行傳代；

②吸引器吸去培養皿中的液體，加入1ml 37℃預熱的0.25％的胰蛋白酶溶液，倒置顯微鏡下觀察到貼壁細胞收縮、細胞間隙變大、細胞由貼壁的多角形狀變為圓形后，去除胰蛋白酶；

③迅速加入1640/DMEM培養基，終止胰蛋白酶消化作用。用3ml移液槍反復吹打使貼壁細胞懸??；

④將細胞懸液等量移入2-3個25ml培養瓶中，向每個培養瓶中加入含10％新生牛血清1640培養基至總量約5ml，置于37℃、5％CO₂的飽和濕度細胞培養箱中繼續培養。HPAECs細胞的培養液采用1640培養基，加入雙抗，青霉素濃度為：100U/ml，鏈霉素濃度為100μg/ml；

3)培養細胞的凍存：

①取對數生長期細胞，棄去培養液；

②用0.25％的胰蛋白酶消化后，加入含10％新生牛血清培養基，反復吹打貼壁細胞；

③將細胞懸液移入15ml尖底無菌離心管中，1000rpm離心10min，加入配好的凍存培養液，含10％DMSO，使凍存液中細胞的最終濃度為5x10⁶/ml；

④用吸管移入凍存管中，放入程序降溫凍存盒，移入液氮罐中保存；

4)建立氯化鈷HPAECs低氧模型，HPAECs隨機分為五組：空白對照組、低氧誘導組、低氧+不同濃度黃芪多糖低、中、高干預組；

①空白對照組:將培養板置于常溫培養箱內，向培養板內加入含10％空白藥物血清的DMEM/F12培養液；

②低氧誘導組:將培養板置于常溫培養箱內，以0.1％的氯化鈷作用l2小時，同時向培養板內加入含10％空白藥物血清的DMEM/F12培養液；

③黃芪多糖含藥血清低中高濃度組:常溫培養箱內，以0.1％的氯化鈷作用l2小時，分別同時向培養板內加入含1mmol/L、5mmol/L、10mmol/L黃芪多糖藥物血清的DMEM/F12培養液；釆用貼壁法培養HPAECs:將HPAECs細胞株復蘇，每隔一天更換培養液一次，待瓶底覆蓋約80％，以胰蛋白酶消化傳代培養，選用生長良好的3—5代細胞進行試驗；

5)ELISA測定不同組間HPAECs上清液中Nrf2、SOD、GSH–PX；

①.用50mM的碳酸鹽包被緩沖液溶解細胞上清，使受測因子濃度為10-20μg/ml，加100μl/孔到96孔酶標板，4℃放置過夜；

②.第二天棄去包被液后，用PBST洗滌3次，每孔加入150μl 1％BSA 37℃封閉1小時；

③.PBST洗滌3次后，每孔加入100μl不同倍比稀釋度的上清，并加入對照樣品，37℃孵育2小時；

④.PBST洗滌5次后，加入100μl稀釋后的HRP標記的二抗，37℃孵育1小時；

⑤.PBST洗滌5次后，顯色劑顯色20min后，酶標儀上讀取A405吸收值。