[發(fā)明專利]一種用于風(fēng)信子屬植物根尖染色體熒光原位雜交染色體制片的處理方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910083599.2
• 申請(qǐng)日: 2019-01-29
• 公開（公告）號(hào): CN109576348B
• 公開（公告）日: 2022-02-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡鳳榮;蘇曉倩;張鴿香;丁彥芬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京林業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6806
• 分類號(hào): C12Q1/6806;C12Q1/6841
• 代理公司: 濟(jì)南泉城專利商標(biāo)事務(wù)所 37218
• 代理人: 王翠翠

本發(fā)明公開一種用于風(fēng)信子屬植物根尖染色體熒光原位雜交染色體制片的處理方法，包括風(fēng)信子染色體制片和染色體制片處理，重點(diǎn)解決了風(fēng)信子利用現(xiàn)有熒光原位雜交技術(shù)很難檢測(cè)到清晰雜交信號(hào)的缺陷。風(fēng)信子屬植物根尖含有多糖、多酚等次生代謝物，水培風(fēng)信子根系直徑約1.5?2.0 mm，分生區(qū)域被較厚的表皮細(xì)胞包裹在根尖中部，因此壓片時(shí)雜質(zhì)較多，獲得的染色體制片直接用于FISH雜交，很難檢測(cè)到清晰的雜交信號(hào)，本發(fā)明通過(guò)酶處理染色體制片后再進(jìn)行FISH雜交能夠捕捉到微小但清晰的信號(hào)。本方法處理的風(fēng)信子屬根尖染色體制片適用于45S rDNA探針、5S rDNA探針、18S rDNA探針、端粒探針等FISH雜交。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于風(fēng)信子屬植物根尖染色體熒光原位雜交染色體制片的處理方法。

背景技術(shù)

熒光原位雜交技術(shù) (fluorescence in situ hybrization，F(xiàn)ISH) 是在 20 世紀(jì)80年代末在放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種非放射性分子細(xì)胞遺傳技術(shù)，以熒光標(biāo)記取代同位素標(biāo)記而形成的一種新的原位雜交方法，能夠?qū)⑴c探針互補(bǔ)的 DNA 序列直觀的定位到染色體上，并且寡拷貝的探針還能夠錨定在單一的染色體上，不僅提高了實(shí)驗(yàn)的靈敏度，還大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期。 目前，該方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于遺傳作圖、轉(zhuǎn)基因定位、染色體畸變檢測(cè)、基因組結(jié)構(gòu)和物種進(jìn)化分析等方面。FISH技術(shù)已在很多植物上運(yùn)用成功，但是，球根花卉含有較多的多糖、多酚等次生代謝物，根尖分生區(qū)雜質(zhì)較多，目前關(guān)于百合、石蒜、郁金香等球根花卉的熒光原位雜交研究較為成熟，但風(fēng)信子屬植物水培根尖含有較多雜質(zhì)，染色體制片直接用于熒光原位雜交技術(shù)無(wú)法獲得清晰的雜交信號(hào)。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種用于風(fēng)信子屬熒光原位雜交染色體制片的處理方法。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種用于風(fēng)信子屬植物根尖染色體熒光原位雜交染色體制片的處理方法，包括以下步驟：

（1）風(fēng)信子染色體制片；

（2）染色體制片處理。

上述方法中步驟（1）中染色體制片的步驟為：

（1）選取水培風(fēng)信子根尖，當(dāng)水培根系長(zhǎng)達(dá)1 cm時(shí)，在9:00-11:00剪取水培根尖放入10 ml盛有預(yù)處理液的離心管中，進(jìn)行預(yù)處理；

（2）預(yù)處理液由0.2％秋水仙素與0.002 M 8-羥基喹啉混合液1:1配制而成，處理20 h后轉(zhuǎn)至卡諾氏固定液I（無(wú)水乙醇：冰乙酸=3:1）固定24 h，4℃貯存?zhèn)溆茫?/p>

（3）隨機(jī)選取風(fēng)信子品種各10條根，45%乙酸解離1.5-2 h；

（4）45%乙酸壓片；

（5）Olympus BX41相差顯微鏡鏡檢，選取分裂相較好的染色體制片備用；

（6）揭片：①冷凍揭片（超低溫冰箱-70℃冷凍過(guò)夜）；②液氮揭片（液氮處理30秒），揭片后立即放入無(wú)水乙醇脫水半小時(shí)以上，氣干，室溫貯藏備用。

上述方法中步驟（2）中染色體制片處理液配制的步驟為：

（1）RNA酶A：濃度25mg/mL，用1×TE 進(jìn)行溶解，-20℃保存，使用前用2×SSC進(jìn)行稀釋；

（2）4%胃蛋白酶：用0.1 mol/L HCl進(jìn)行溶解，4℃保存，使用前用0.1 mol/L HCl稀釋；

（3）4%多聚甲醛：ddH₂O 900μl和1mol/L NaOH 500μl加熱至65～70℃，加入多聚甲醛40 g，加熱并攪拌直到充分溶解，冷卻至室溫，加入100 μl 10×PBS，加HCl調(diào)至pH7.3，抽慮滅菌后分裝，4℃避光保存。