[發明專利]一種用于風信子屬植物根尖染色體熒光原位雜交染色體制片的處理方法

有效

• 申請號: 201910083599.2
• 申請日: 2019-01-29
• 公開（公告）號: CN109576348B
• 公開（公告）日: 2022-02-18
• 發明（設計）人: 胡鳳榮;蘇曉倩;張鴿香;丁彥芬
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6841
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 王翠翠

1.一種用于風信子屬植物根尖染色體熒光原位雜交的染色體制片的處理方法，其特征在于，包括以下步驟：

一、風信子染色體制片；

（1）選取水培風信子根尖，當水培根系長達1cm時，在9:00-11:00剪取水培根尖放入10ml盛有預處理液的離心管中，進行預處理；

（2）預處理液由0.2％秋水仙素與0.002 M 8-羥基喹啉混合液1:1配制而成，處理20 h后轉至卡諾氏固定液I固定24 h，4℃貯存備用，固定液I為無水乙醇：冰乙酸的體積比3:1；

（3）隨機選取風信子品種各10條根，45%乙酸解離1.5-2h；

（4）45%乙酸壓片：取一條解離后的根，先切去根冠，再將分生區域橫切為0.1 mm的薄片，取三張薄片平置于一片一側帶毛邊的干凈載玻片上，滴一滴45%乙酸溶液，20mm× 20mm的蓋玻片蓋片，壓住蓋片一角，用解剖針垂直敲擊分生薄片區域，待根切片全部分散，酒精燈烤片至霧氣將散，濾紙吸干，垂直用力壓片；

（5）Olympus BX41相差顯微鏡鏡檢，選取分裂相較好的染色體制片備用；

（6）揭片：①冷凍揭片，超低溫冰箱-70℃冷凍過夜；②液氮揭片，液氮處理30秒，揭片后立即放入無水乙醇脫水半小時以上，氣干，室溫貯藏備用；

二、染色體制片處理：染色體制片處理液配制，染色體制片處理；

所述的染色體制片處理液配制的步驟為：

（1）RNA酶A：濃度25mg/mL，用1×TE 進行溶解，-20℃保存備用，使用前用2×SSC稀釋至終濃度50μg/μL；

（2）4%胃蛋白酶：用0 .1 mol/L HCl進行溶解，4℃保存，使用前用0 .1 mol/L HCl稀釋至終濃度50 mg/ml；

（3）4%多聚甲醛：ddH₂O 900μl和1mol/L NaOH 500μl加熱至65～70℃，加入多聚甲醛40g，加熱并攪拌直到充分溶解，冷卻至室溫，加入100μl 10×PBS，加HCl調至pH7.3，抽慮滅菌后分裝，4℃避光保存；

所述的染色體制片處理的步驟為：

將染色體制片置于50 μg/μL RNA酶A的2×SSC溶液中，37℃酶解 30-40 min；轉入4%胃蛋白酶的0 .1 mol/L鹽酸溶液中，37℃酶解6-8 min；再轉入4%多聚甲醛溶液中，室溫避光處理10 min；然后70%、95%、100%乙醇中梯度脫水各3 min，氣干，室溫貯藏備用，處理過程中要保證染色體標本全部浸在處理液中；

所述的染色體為5S rDNA。