[發(fā)明專利]一種用于風(fēng)信子屬植物根尖染色體熒光原位雜交染色體制片的處理方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910083599.2
• 申請日: 2019-01-29
• 公開（公告）號: CN109576348B
• 公開（公告）日: 2022-02-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 胡鳳榮;蘇曉倩;張鴿香;丁彥芬
• 申請（專利權(quán)）人: 南京林業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6841
• 代理公司: 濟南泉城專利商標(biāo)事務(wù)所 37218
• 代理人: 王翠翠

1.一種用于風(fēng)信子屬植物根尖染色體熒光原位雜交的染色體制片的處理方法，其特征在于，包括以下步驟：

一、風(fēng)信子染色體制片；

（1）選取水培風(fēng)信子根尖，當(dāng)水培根系長達1cm時，在9:00-11:00剪取水培根尖放入10ml盛有預(yù)處理液的離心管中，進行預(yù)處理；

（2）預(yù)處理液由0.2％秋水仙素與0.002 M 8-羥基喹啉混合液1:1配制而成，處理20 h后轉(zhuǎn)至卡諾氏固定液I固定24 h，4℃貯存?zhèn)溆茫潭ㄒ篒為無水乙醇：冰乙酸的體積比3:1；

（3）隨機選取風(fēng)信子品種各10條根，45%乙酸解離1.5-2h；

（4）45%乙酸壓片：取一條解離后的根，先切去根冠，再將分生區(qū)域橫切為0.1 mm的薄片，取三張薄片平置于一片一側(cè)帶毛邊的干凈載玻片上，滴一滴45%乙酸溶液，20mm× 20mm的蓋玻片蓋片，壓住蓋片一角，用解剖針垂直敲擊分生薄片區(qū)域，待根切片全部分散，酒精燈烤片至霧氣將散，濾紙吸干，垂直用力壓片；

（5）Olympus BX41相差顯微鏡鏡檢，選取分裂相較好的染色體制片備用；

（6）揭片：①冷凍揭片，超低溫冰箱-70℃冷凍過夜；②液氮揭片，液氮處理30秒，揭片后立即放入無水乙醇脫水半小時以上，氣干，室溫貯藏備用；

二、染色體制片處理：染色體制片處理液配制，染色體制片處理；

所述的染色體制片處理液配制的步驟為：

（1）RNA酶A：濃度25mg/mL，用1×TE 進行溶解，-20℃保存?zhèn)溆茫褂们坝?×SSC稀釋至終濃度50μg/μL；

（2）4%胃蛋白酶：用0 .1 mol/L HCl進行溶解，4℃保存，使用前用0 .1 mol/L HCl稀釋至終濃度50 mg/ml；

（3）4%多聚甲醛：ddH₂O 900μl和1mol/L NaOH 500μl加熱至65～70℃，加入多聚甲醛40g，加熱并攪拌直到充分溶解，冷卻至室溫，加入100μl 10×PBS，加HCl調(diào)至pH7.3，抽慮滅菌后分裝，4℃避光保存；

所述的染色體制片處理的步驟為：

將染色體制片置于50 μg/μL RNA酶A的2×SSC溶液中，37℃酶解 30-40 min；轉(zhuǎn)入4%胃蛋白酶的0 .1 mol/L鹽酸溶液中，37℃酶解6-8 min；再轉(zhuǎn)入4%多聚甲醛溶液中，室溫避光處理10 min；然后70%、95%、100%乙醇中梯度脫水各3 min，氣干，室溫貯藏備用，處理過程中要保證染色體標(biāo)本全部浸在處理液中；

所述的染色體為5S rDNA。