[發明專利]一種快速鑒定風信子園藝品種染色體倍性的方法

有效

• 申請號: 201910083560.0
• 申請日: 2019-01-29
• 公開（公告）號: CN109609602B
• 公開（公告）日: 2020-09-29
• 發明（設計）人: 胡鳳榮;蘇曉倩;丁彥芬;張鴿香
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C12Q1/6841
• 分類號: C12Q1/6841;C12Q1/6806
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 王翠翠

本發明公開了一種快速鑒定風信子園藝品種染色體倍性的方法，主要包括以下步驟：風信子染色體制片；45S rDNA探針標記；FISH雜交；與百合、郁金香等球根花卉不同，45S rDNA FISH雜交信號定位在風信子染色體的次縊痕處，且在不同風信子品種中具隨體的染色體是相對穩定的，可以快速鑒定園藝風信子品種的染色體倍性。利用Fluorescein?12?dUTP標記的45S rDNA探針對40個園藝風信子品種進行了染色體倍性鑒定，發現8個二倍體、10個三倍體和22個四倍體。本發明填補了快速鑒定風信子品種染色體倍性方法的空白。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種快速鑒定風信子園藝品種染色體倍性的方法。

背景技術

熒光原位雜交技術 (fluorescence in situ hybrization，FISH)是在原位雜交技術基礎上發展起來的一項細胞遺傳學技術，用熒光素代替放射性元素對探針進行標記，這不僅提高了實驗的靈敏度，還大大縮短了實驗周期。為染色體的研究提供了很大的便利。目前，該方法已經廣泛應用于遺傳作圖、轉基因定位、染色體畸變檢測、基因組結構和物種進化分析等方面。目前，確定植物染色體倍性的方法主要是涂片或壓片進行核型分析、流式細胞術，但核型分析步驟繁瑣，而流式細胞術對于未知植物倍性的鑒定需要結合染色體核型分析，才能得到全面準確的檢測結果。目前尚未有關更為快速有效的植物染色體鑒定方法的報道。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供一種快速鑒定風信子園藝品種染色體倍性的方法。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種快速鑒定風信子園藝品種染色體倍性的方法，包括以下步驟：

（1）風信子染色體制片；

（2）染色體制片處理

（3）45S rDNA 探針標記；

（4）45S rDNA FISH雜交，信號定位在次縊痕處，根據雜交信號位點的數目快速鑒定園藝風信子品種的染色體倍性。

本方法步驟（1）中染色體制片的步驟為：

（1）選取水培風信子根尖，當水培根系長達1cm時，在9:00-11:00剪取水培根尖放入10 ml盛有預處理液的離心管中，進行預處理；

（2）預處理液由0.2％秋水仙素與0.002 M 8-羥基喹啉混合液1:1配制而成，處理20 h后轉至卡諾氏固定液I固定24 h，4℃貯存備用，固定液I為無水乙醇：冰醋酸的體積比3:1；

（3）隨機選取各風信子品種10條根尖，45%醋酸解離1.5-2 h；

（4）45%醋酸壓片；

（5）Olympus BX41相差顯微鏡鏡檢，選取分裂相較好的染色體制片備用；

（6）揭片：①冷凍揭片（超低溫冰箱-70℃冷凍過夜）；②液氮揭片（液氮處理30秒），揭片后立即放入無水乙醇脫水半小時以上，氣干，室溫貯藏備用。

本方法步驟（2）染色體制片處理的步驟為：

將染色體制片置于50 μg/μL RNA酶A的2×SSC溶液中，37℃酶解 30-40 min；轉入4%胃蛋白酶的0.1 mol/L鹽酸溶液中，37℃ 酶解6-8 min；再轉入4%多聚甲醛溶液中，室溫避光處理10 min；然后70%、95%、100%乙醇中梯度脫水各3 min，氣干，室溫貯藏備用（處理過程中要保證染色體標本全部浸在處理液中）。

本方法步驟（3）中45S rDNA 探針標記的步驟為：

（1）探針來源：標記探針的模板DNA采用通用引物克隆自水稻，保存在大腸桿菌中，標記探針前采用堿法提取質粒DNA，-20℃保存備用；