[發明專利]一種快速鑒定風信子園藝品種染色體倍性的方法

有效

• 申請號: 201910083560.0
• 申請日: 2019-01-29
• 公開（公告）號: CN109609602B
• 公開（公告）日: 2020-09-29
• 發明（設計）人: 胡鳳榮;蘇曉倩;丁彥芬;張鴿香
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C12Q1/6841
• 分類號: C12Q1/6841;C12Q1/6806
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 王翠翠

1.一種快速鑒定風信子園藝品種染色體倍性的方法，其特征在于，包括以下步驟：

一、風信子染色體制片；

染色體制片的步驟為：

（1）選取水培風信子根尖，當水培根系長達1cm時，在9:00-11:00剪取水培根尖放入10ml盛有預處理液的離心管中，進行預處理；

（2）預處理液由0.2％秋水仙素與0.002 M 8-羥基喹啉混合液1:1配制而成，處理20 h后轉至卡諾氏固定液I固定24 h，4℃貯存備用，所述卡諾氏固定液I由體積比為3:1的無水乙醇和冰醋酸組成；

（3）隨機選取各風信子品種10條根尖，45%醋酸解離1.5-2 h；

（4）45%醋酸壓片；

（5）Olympus BX41相差顯微鏡鏡檢，選取分裂相較好的染色體制片備用；

（6）揭片：① 冷凍揭片：超低溫冰箱-70 ℃冷凍過夜，或② 液氮揭片:液氮處理30秒；揭片后立即放入無水乙醇脫水半小時以上，氣干，室溫貯藏備用；

二、染色體制片處理；

染色體制片處理的步驟為：

將染色體制片置于50 μg/μL RNA酶A的2×SSC溶液中，37℃酶30-40 min；轉入4%胃蛋白酶的0.1 mol/L鹽酸溶液中，37℃ 酶解6-8 min；再轉入4%多聚甲醛溶液中，室溫避光處理10 min；然后70%、95%、100%乙醇中梯度脫水各3 min，氣干，室溫貯藏備用，處理過程中要保證染色體標本全部浸在處理液中；

三、45S rDNA 探針標記；

45S rDNA 探針標記的步驟為：

（1）探針來源：標記探針的模板DNA采用通用引物克隆自水稻；

（2）探針標記：利用缺刻平移法標記探針；

將離心管置于冰上，依次加入：

試 劑	體積或用量
10×緩沖液	5μL
dNTP mix	5μL
模板DNA	1μg
濃度為4U/μL 的DNA 聚合酶 I	2μL
DNase I	1 μL
Fluoresceint-12-dUTP	2μL
2O]]>	使用量為使總體積為50μL的量
總體積	50 μL

混勻反應液，15℃溫育2 h15min，加入pH8.0 的EDTA5 μL，-20℃保存備用；

四、45S rDNA FISH雜交，信號定位在次縊痕處，根據雜交信號位點的數目快速鑒定園藝風信子品種的染色體倍性；

步驟四中FISH雜交的步驟為：

（1）探針標記：

標記探針的模板DNA采用通用引物克隆自水稻，保存在大腸桿菌中，標記探針前采用堿法提取質粒DNA，-20℃保存備用；利用缺刻平移法標記45S rDNA探針；

（2）配制雜交液：2張制片

試劑	體積
dFA	15μL
20×SSC	3μL
探針	6μL
50% DS	6μL
總體積	30μL

（3）雜交

標記好的探針和備用的染色體制片無需變性，可直接用于FISH雜交，每張制片滴15 μL雜交液，蓋上20×20的蓋玻片，37℃雜交1 h；

（4）洗片

雜交后洗滌，2×SSC室溫洗滌2-3次，每次5 min，再用ddH₂O室溫洗滌3 min，瀝干制片；

（5）套染

利用碘化丙錠（PI）對制片進行套染，步驟如下：

在999 μL 1×PBS中加入1.2 μL PI母液混勻，配成終濃度為100 μg/mL染液，每張制片滴加500 μL，染色2 min，1×PBS沖洗4-5次，滴加10 μL Vectashield 膠，蓋上蓋片，OlympusBX51型熒光顯微鏡下用450-490nm激發光波長觀察、DP72攝像系統拍照。