[發明專利]穩定表達FGF-1蛋白細胞株的構建方法

在審

• 申請號: 201910081720.8
• 申請日: 2019-01-28
• 公開（公告）號: CN109735568A
• 公開（公告）日: 2019-05-10
• 發明（設計）人: 郭建軍;田瑩;檀軍;趙帥;鄭玉林;陳緖美;尹志勇
• 申請（專利權）人: 貴州大學
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10;C12N15/12
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所 52100
• 代理人: 李亮;程新敏

本發明公開了一種穩定表達FGF?1蛋白細胞株的構建方法。在pLenti?CMV?Gag?Mcherry?Puro載體的Not I和Avr II多克隆位點處插入FGF?1基因，用構建好的pLenti?CMV?FGF?1?Emcherry?Puro重組質粒與病毒包裝質粒共轉染293T細胞，培養、出毒、收取病毒上清、過濾得重組慢病毒液。將包裝好的重組慢病毒感染293T細胞，通過嘌呤霉素篩選及鑒定，得穩定表達FGF?1蛋白細胞株。本發明利用重組慢病毒系統制備一種融合標簽蛋白并能穩定表達FGF?1蛋白的細胞株，該細胞株為研究FGF?1蛋白的生物學功能提供一個很好的工具。

技術領域

本發明設計醫學分子生物學技術領域，尤其是一種穩定表達FGF-1蛋白細胞株的構建方法。

背景技術

目前，全球超過4億成人患有糖尿病，估計未來10年會增加到6億人以上。糖尿病是一種受遺傳、環境和生活習慣綜合影響導致的慢性代謝疾病，主要分為胰島素依賴型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)、非胰島素依賴型糖尿病(type 2 diabetesmellitus，T2DM)和妊娠期糖尿病。其臨床表現為人體自身不能產生胰島素或者不能利用胰島素，導致血糖高于正常血糖范圍，從而引起一些并發性疾病。糖尿病及其并發癥降低了患者的預期壽命和生活質量，而且每年糖尿病的死亡率、發病率和相關的衛生保健支出都在逐步上升。常規糖尿病治療藥物大多存在療效不持久、副作用較多及易出現胰島素耐受等弊端。因此，迫切需要研發更有效與更安全的糖尿病治療藥物。

2014年，發現新型的調節血糖因子——酸性成纖維細胞生長因子(acidicfibroblast growth factor，aFGF或FGF1)，同時具備胰島素增敏效果，為治療胰島素抵抗的T2DM帶來了新的希望。近年來，FGF1作為胰島素增敏劑的發現，在顯著降低血糖、改善胰島素抵抗、減少副作用方面已被證實。并且，結構優化后的重組FGF1蛋白促有絲分裂的能力更低。因此，比野生型FGF1在實驗動物體內代謝作用更為有效。和臨床降糖藥相比，作用持續時間更長、安全性更高；在治療T2DM方面，FGF1與FGF家族的其他成員相比，有著特異性降糖作用。

發明內容

本發明的目的是：提供一種穩定表達FGF-1蛋白細胞株的構建方法，利用重組慢病毒系統制備一種融合標簽蛋白并能穩定表達FGF-1蛋白的細胞株，該細胞株為研究FGF-1蛋白的生物學功能提供一個很好的工具。

本發明是這樣實現的：穩定表達FGF-1蛋白細胞株的構建方法，包括如下步驟：

1)FGF-1基因的擴增；

2)將FGF-1基因與載體pLenti-CMV-Gag-Mcherry-Puro(購自北京基石生命科技有限公司)連接，構建重組慢病毒表達質粒pLenti-CMV-FGF-1-Emcherry-Puro；

3)將重組慢病毒表達質粒pLenti-CMV-FGF-1-Emcherry-Puro與慢病毒包裝質粒psPAX2及pVSV-G共轉染293T細胞，48h后，收集上清，72000×g離心4h獲得高度濃縮的慢病毒顆粒；

4)將包裝好的重組慢病毒CMV-mcherry-LVP轉染293T細胞，通過嘌呤霉素篩選陽性細胞株，對陽性細胞株進行細胞免疫熒光鑒定，獲得穩定表達FGF-1蛋白細胞株。

所述的步驟1)具體是，以FGF-1-F和FGF-1-R為特異性引物，添加酶切位點Not I和Avr II，以質粒pEmcherry-N1-FGF-1為模板，進行PCR擴增；所述的特異性引物FGF-1-F的序列如序列表SEQ ID 1所示，FGF-1-R的序列如序列表SEQ ID 2所示。

PCR擴增體系為：PCR反應程序：94℃變性2min，56℃復性1min，72℃延伸2min，共循環30次，最后72℃再延伸10min。PCR結束后，取2μl擴增產物在瓊脂糖凝膠上電泳，分離、回收純化。