[發明專利]穩定表達FGF-1蛋白細胞株的構建方法

在審

• 申請號: 201910081720.8
• 申請日: 2019-01-28
• 公開（公告）號: CN109735568A
• 公開（公告）日: 2019-05-10
• 發明（設計）人: 郭建軍;田瑩;檀軍;趙帥;鄭玉林;陳緖美;尹志勇
• 申請（專利權）人: 貴州大學
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10;C12N15/12
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所 52100
• 代理人: 李亮;程新敏

1.一種穩定表達FGF-1蛋白細胞株的構建方法，其特征在于：包括如下步驟：

1)FGF-1基因的擴增；

2)將FGF-1基因與載體pLenti-CMV-Gag-Mcherry-Puro連接，構建重組慢病毒表達質粒pLenti-CMV-FGF-1-Emcherry-Puro；

3)將重組慢病毒表達質粒pLenti-CMV-FGF-1-Emcherry-Puro與慢病毒包裝質粒psPAX2及pVSV-G共轉染293T細胞，48h后，收集上清，72000×g離心4h獲得高度濃縮的慢病毒顆粒；

4)將包裝好的重組慢病毒CMV-mcherry-LVP轉染293T細胞，通過嘌呤霉素篩選陽性細胞株，對陽性細胞株進行細胞免疫熒光鑒定，獲得穩定表達FGF-1蛋白細胞株。

2.根據權利要求1所述的穩定表達FGF-1蛋白細胞株的構建方法，其特征在于：所述的步驟1)具體是，以FGF-1-F和FGF-1-R為特異性引物，添加酶切位點Not I和Avr II，以質粒pEmcherry-N1-FGF-1為模板，進行PCR擴增；所述的特異性引物FGF-1-F的序列如序列表SEQID 1所示，FGF-1-R的序列如序列表SEQ ID 2所示。

3.根據權利要求2所述的穩定表達FGF-1蛋白細胞株的構建方法，其特征在于：PCR擴增體系為：PCR反應程序：94℃變性2min，56℃復性1min，72℃延伸2min，共循環30次，最后72℃再延伸10min。PCR結束后，取2μl擴增產物在瓊脂糖凝膠上電泳，分離、回收純化。

4.根據權利要求1所述的穩定表達FGF-1蛋白細胞株的構建方法，其特征在于：步驟(3)中，所述的病毒包裝質粒是psPAX2和pVSV-G。