[發明專利]一種通過轉化凡納濱對蝦抗菌肽pen3基因提高浮萍及其液體培養基抗菌能力的方法

在審

• 申請號: 201910077081.8
• 申請日: 2019-01-27
• 公開（公告）號: CN109811003A
• 公開（公告）日: 2019-05-28
• 發明（設計）人: 孫金生;楊琳;曾鍵堯;李娜
• 申請（專利權）人: 天津師范大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00;A01H4/00;A01G31/00
• 代理公司: 天津創智天誠知識產權代理事務所(普通合伙) 12214
• 代理人: 王秀奎

本發明公開了一種通過轉化凡納濱對蝦抗菌肽pen3基因提高浮萍及其液體培養基抗菌能力的方法，本發明以浮萍為材料，利用浮萍轉化體系對浮萍進行轉基因，篩選得到轉化凡納濱對蝦抗菌肽基因pen3的浮萍。經分子生物學鑒定，浮萍基因組DNA具有pen3基因。培養浮萍后的液體培養基和浮萍提取液均具有抑菌能力。本項發明的成套浮萍表達抗菌肽系統不僅完成了基因轉化，而且液體培養基也具有抗菌能力，液體培養基添加到水塘后，是蝦蟹培養過程中非常重要和實用的抑菌途徑，還具備避免魚蝦等水生生物抗生素使用量過高的問題，是魚蝦免疫應用研究中不可缺少的關鍵操作。

本發明得到國家重點研發計劃資助(2018YFD0901301)，國家自然科學基金青年項目(31700443)，天津市水產產業技術體系創新團隊(ITTFRS2017007)的資助。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種通過轉化凡納濱對蝦抗菌肽pen3基因提高浮萍及其液體培養基抗菌能力的方法。

背景技術

浮萍是單子葉水面漂浮植物，隸屬于浮萍科浮萍屬，廣布于世界各地，其個體小，擴繁快，蛋白含量高，通過光照可控制其無性繁殖等顯著優點使其成為理想的高通量外源蛋白表達和基因研究體系?？咕木哂袕V譜抗菌性，并對部分病毒、寄生蟲和癌細胞等均具有抗性，同時可提高免疫力和傷口愈合，是取代常規抗生素、解決致病菌抗藥性問題的極佳選擇。因此，將抗菌肽替代抗生素應用于生產實踐越來越受到科學工作者和水產養殖業的重視。

對蝦素(Penaeidin，Pen)是特異性存在于對蝦體內的一類抗菌肽,能抑制細菌生長繁殖或直接殺滅細菌,主要對革蘭氏陽性菌與真菌有抑菌活性，還可以作為一種調理因子在先天免疫中間接發揮作用。對蝦素由富含脯氨酸的N末端和一個富含半胱氨酸的C端組成，根據氨基酸序列和特定氨基酸被分為五個亞類，Pen-1，-2，-3，-4，-5，Penaeidins 編碼基因已在多種蝦中被克隆和鑒定。

同對蝦種類體內，各種對蝦素的表達水平不同，在凡納濱對蝦體內，Pen2、Pen3、Pen4的轉錄水平較高，其中以Pen3為最高，并且，Pen3是各種對蝦體內普遍存在的高表達基因。pen-3與pen-5已被報道參與了對抗對蝦白斑綜合征病毒(white spot syndromevirus，WSSU)的過程，可利用價值非常高。

發明內容

本發明的目的在于提供一種通過轉化凡納濱對蝦抗菌肽pen3基因提高浮萍及其液體培養基抗菌能力的方法。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種通過轉化凡納濱對蝦抗菌肽pen3基因提高浮萍及其液體培養基抗菌能力的方法，按照下列步驟進行：

(一)獲得浮萍愈傷組織：無菌環境下，切除在液體培養基上培養的浮萍的假根，后橫切浮萍的葉狀體，利用愈傷誘導培養基對其進行愈傷組織的誘導，再利用再培培養基對浮萍愈傷進行愈傷繼代，晝夜周期為16/8小時/天，光強66μmolm^-2s^-1， 21℃下培養愈傷組織21天；

(二)浮萍愈傷組織的轉化：

(1)從甘油凍存管中用穿刺法沾取菌液，利用農桿菌固體培養基平板活化攜帶有凡那濱對蝦抗菌肽pen3表達載體的農桿菌2次；

(2)利用10ml農桿菌液體培養基小體積擴繁農桿菌；

(3)取步驟(2)擴繁好的農桿菌菌液1ml移至40ml加有相應抗生素抗性(kana 50 μg/ml+str 50μg/ml+rif20μg/ml)的農桿菌液體培養基中，28℃培養箱對其進行振蕩培養7～11h，測定菌液在600納米下的OD值，OD₆₀₀為0.42～0.82之間時停止培養；

(4)對步驟(3)獲得的菌液進行常溫離心，5000g 6min，收集沉淀下來的菌體