[發明專利]一種通過轉化凡納濱對蝦抗菌肽pen3基因提高浮萍及其液體培養基抗菌能力的方法

在審

• 申請號: 201910077081.8
• 申請日: 2019-01-27
• 公開（公告）號: CN109811003A
• 公開（公告）日: 2019-05-28
• 發明（設計）人: 孫金生;楊琳;曾鍵堯;李娜
• 申請（專利權）人: 天津師范大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00;A01H4/00;A01G31/00
• 代理公司: 天津創智天誠知識產權代理事務所(普通合伙) 12214
• 代理人: 王秀奎

1.一種通過轉化凡納濱對蝦抗菌肽pen3基因提高浮萍及其液體培養基抗菌能力的方法，其特征在于該方法的步驟包括：

(1)獲得浮萍愈傷組織：獲得浮萍愈傷組織：無菌環境下，切除在液體培養基上培養的浮萍的假根，后橫切浮萍的葉狀體，利用愈傷誘導培養基對其進行愈傷組織的誘導，再利用再培培養基對浮萍愈傷進行愈傷繼代，晝夜周期為16/8小時/天，光強66μmolm^-2s^-1，21℃下培養愈傷組織21天；

(2)浮萍愈傷組織的轉化：

1)用穿刺法從甘油凍存管中沾取菌液，利用農桿菌固體培養基平板活化攜帶有凡那濱對蝦抗菌肽pen3表達載體的農桿菌2次；

2)利用10ml農桿菌液體培養基對農桿菌進行小體積擴繁；

3)取步驟2)擴繁好的農桿菌菌液1ml移至40ml加有相應抗生素抗性(kana 50μg/ml+str 50μg/ml+rif20μg/ml)的農桿菌液體培養基中，28℃培養箱對其進行振蕩培養7～11h，測定菌液在600納米下的OD值，OD₆₀₀為0.42～0.82之間時停止培養；

4)對步驟3)獲得的菌液進行常溫離心，5000g 6min，收集沉淀下來的菌體

5)利用轉化培養液溶解菌體(共培養液成分為B5液體培養基+1％蔗糖+0.2％Tween20)；

6)用消毒后的鑷子在超凈臺無菌條件下夾取浮萍愈傷組織，將其轉移至轉化培養菌液內，室溫下抽真空3次，每次1分鐘；

7)28℃緩慢振蕩共培養30min；

8)將共培養液體吸出，將外植體置于濾紙上待菌液徹底被吸干后，將愈傷組織移至固體共培養培養基上；

9)固體共培養1～3d，長出菌圈后，用無菌水(含300mg/L頭孢霉素)清洗愈傷組織3～5次，濾紙吸干后，移至篩選培養基(繼代培養基+30mg/L潮霉素+300mg/L頭孢霉素)上；

10)篩選20d后，將愈傷組織移至再生培養基(含潮霉素0.5mg/L，頭孢霉素300mg/L)上；

11)20天浮萍再生成功后，將浮萍移至DATKO液體培養基(含潮霉素1mg/L)中。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于第1)步所述的浮萍愈傷誘導培養基的組成包括：2500mg/l KNO3、250mg/l MgSO₄·7H₂O、121mg/l CaCl₂·2H₂O、134mg/l(NH₄)₂SO₄、169.6mg/l NaH₂PO₄·2H₂O、0.025mg/l、27.8mg/l FeSO₄·7H₂O、2.0mg/l ZnSO₄·7H₂O、0.025mg/l CoCl₂·6H₂O、0.25mg/l Na₂MoO₄·2H₂O、0.025mg/l CuSO₄·5H₂O、0.75mg/l KI、3.0mg/l H₃BO₄、10mg/l MnSO₄·4H₂O、27.8mg/l FeSO₄·7H₂O、1.5％蔗糖、100mg/l肌醇、1.0mg/l煙酸、1.0mg/l維生素B6、10mg/l維生素B1、1.5％麥草畏、2.5％2,4-D、1.5％6-BA、0.6％瓊脂。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于第(1)步所述的浮萍愈傷再培培養基的組成包括：2500mg/l KNO₃、250mg/l MgSO₄·7H₂O、121mg/l CaCl₂·2H₂O、134mg/l(NH₄)₂SO₄、169.6mg/l NaH₂PO₄·2H₂O、0.75mg/l KI、3.0mg/l H₃BO₄、10mg/l MnSO₄·4H₂O、27.8mg/lFeSO₄·7H₂O、2.0mg/l ZnSO₄·7H₂O、0.25mg/l Na₂MoO₄·2H₂O、0.025mg/l CoCl₂·6H₂O、0.025mg/l CuSO₄·5H₂O、1.5％蔗糖、100mg/l肌醇、1.0mg/l煙酸、1.0mg/l維生素B6、10mg/l維生素B1、10mg/L PCA、2mg/L 2iP、0.6％瓊脂。