[發明專利]一種利用花生蛋白酶解物培養CHO細胞的方法

有效

• 申請號: 201910075938.2
• 申請日: 2019-01-25
• 公開（公告）號: CN109628378B
• 公開（公告）日: 2020-07-17
• 發明（設計）人: 張慧君;杜勇;陳太標
• 申請（專利權）人: 江蘇豐華生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開一種利用花生蛋白酶解物培養CHO細胞的方法，利用含有花生蛋白酶解物的無血清培養基對TNK?tPA表達CHO細胞株進行流加培養，所述花生蛋白酶解物的水解度大于50%，相對于無血清培養基的終濃度為1.0?4.0mg/ml。本發明利用花生蛋白酶解物代替谷氨酰胺，用于重組CHO細胞的體外培養方法，以提高TNK?tPA的表達水平。在培養周期內，TNK?tPA的表達、分泌水平可以達到較高水平，將TNK?tPA的終產量提高了近數倍，并且易于后續的規模放大和工業化生產。

技術領域

本發明屬于治療性重組蛋白質藥物領域，具體涉及一種利用花生蛋白酶解物培養CHO細胞的方法。

背景技術

近年來，利用哺乳動物細胞制備治療性蛋白質藥物的市場需求日益增強。在重組蛋白質藥物領域，哺乳動物細胞的流加批次(Fed-batch)培養和灌流（Perfusion）培養是大規模生產重組糖基化蛋白的兩大平臺。對于具體的蛋白質藥物而言，在考慮平臺選擇時，需要綜合考慮諸多參數和影響因素，如目標蛋白的理化性質、細胞系的生物學性質、目標蛋白的表達分泌水平、終產品的質量與穩定性、生產規模、分離純化能力、成本等。

但哺乳動物細胞作為“生物微工廠”存在著產能較低、成本較高等問題。為克服這些障礙，研究人員在諸如細胞系選擇、克隆技術篩選、表達載體構建、培養基優化、代謝工程優化、生物反應器工藝改進等方面做了大量研究。其中，通過優化培養基配方聯合流加批次（fed-batch）培養已經成為改善哺乳動物細胞產能的最為有效途徑。利用此組合技術，在過去的10余年間重組蛋白的產量從50mg/L增加到了10g/L。

為獲得哺乳動物細胞的高生長速率、高細胞密度和高產能，通常在流加培養時需要補充高濃度的谷氨酰胺作為細胞生產的能量。但是，高濃度谷氨酰胺在細胞培養過程中會產生副產物銨鹽。由于流加批次培養常需要20天以上，致使銨鹽的濃度可以累積高至20mM，這樣高濃度的代謝副產物銨鹽反過來會抑制細胞的生產和產能，致使重組蛋白的終產量降低。為減輕銨鹽的累積速率，研究人員通過降低谷氨酰胺的流加速率、離子交換層析、肝細胞共培養、篩選谷氨酰胺代替物等技術手段來減低銨鹽的濃度。

TNK-tPA即重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體，也稱TNKase或Tenecteplase。 TNK-tPA屬于第三代溶栓藥物，通過激活血栓表面的纖溶酶原而啟動機體的溶纖系統臨床上主要用于心腦血管栓塞、肺栓塞等的溶栓治療。

國內公開的TNK-tPA規模培養技術有兩項：在“一種用于動物細胞無血清結團灌流培養的方法”（專利授權號為CN100543131C）的發明專利中，公開了動物細胞無血清結團灌流培養工藝，據其介紹，采用超聲-沉降雙結合的灌流系統，可以使動物細胞形成團狀聚集，從而達到提高細胞密度的目的。這項技術的缺點是要求特定的發酵系統、工藝復雜而難以自動化、細胞結團的影響因素過多而致批間差增大等。在“微載體培養重組人組織型纖溶酶原激活劑tnk突變體的工藝”（公開號為CN101096655A）的發明專利中，公開了重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體(rhTNK-tPA) （ TNK-tPA）的生產新工藝，此工藝采用Cytopore多孔微載體培養法生產重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體，產量可以達到55mg/L。

從上述授權專利或專利申請的內容可以看出，兩者都存在著TNK-tPA產量過低的缺陷，致使大規模工業化生產的產能不足、成本過高，難以實現產業化和商業化。

發明內容

有鑒于此，本發明提供一種利用花生蛋白酶解物培養CHO細胞的方法。

本發明是通過下述技術方案實現的。

一種利用花生蛋白酶解物培養CHO細胞的方法，其特征在于：利用含有花生蛋白酶解物的無血清培養基對TNK-tPA表達CHO細胞株進行流加培養，所述花生蛋白酶解物的水解度大于50%，相對于無血清培養基的終濃度為1.0-4.0mg/ml。

優選地，所述終濃度為2.0-4.0mg/ml；