[發(fā)明專(zhuān)利]一種培養(yǎng)擴(kuò)增人肝祖細(xì)胞的培養(yǎng)基及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910073515.7
• 申請(qǐng)日: 2019-01-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111607556B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-06-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李尹雄;潘廷才;陳彥;莊苑琦;楊帆
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/071
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/071;C12Q1/02;A61L27/38
• 代理公司: 北京品源專(zhuān)利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

本發(fā)明提供了一種擴(kuò)增培養(yǎng)人肝祖細(xì)胞的培養(yǎng)基及其應(yīng)用，所述培養(yǎng)基配方化學(xué)成分明確，無(wú)血清，各組分相互配合，協(xié)同增效，用于體外長(zhǎng)期擴(kuò)增培養(yǎng)肝祖細(xì)胞并維持其干性，有助于快速高效的獲取大量的具有功能的肝細(xì)胞，適宜于臨床肝細(xì)胞移植應(yīng)用以及生物人工肝中的肝細(xì)胞反應(yīng)器使用，將為每年新增的百萬(wàn)代償期/失代償期肝硬化患者及其急性肝中毒患者的生命帶來(lái)希望，具有廣闊的應(yīng)用前景和巨大的市場(chǎng)價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種培養(yǎng)擴(kuò)增人肝祖細(xì)胞的培養(yǎng)基及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

我國(guó)是肝病大國(guó)，有超過(guò)1億人群患有病毒性肝炎、脂肪肝和肝纖維化等各類(lèi)肝病，其中有約3000萬(wàn)的慢性肝炎患者是高風(fēng)險(xiǎn)人群，部分患者進(jìn)行性發(fā)展為肝纖維化、肝硬化、肝衰竭和肝癌等重癥肝病。每年有超過(guò)100萬(wàn)新發(fā)病例進(jìn)入肝硬化失代償期，50萬(wàn)左右死于肝衰竭，另有幾千人死于食源或藥源性肝中毒導(dǎo)致的肝衰竭，這些各類(lèi)因素導(dǎo)致的肝臟疾病造成巨大的社會(huì)和家庭負(fù)擔(dān)。

目前治療肝衰竭的唯一有效方法就是肝臟移植。我國(guó)每年等待肝移植的病人大于50萬(wàn)，而能用于移植的肝臟來(lái)源數(shù)目在數(shù)百至一千余例，極其有限的肝臟器官來(lái)源遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足巨大而急迫的臨床需求。已有的臨床治療和臨床前研究表明，生物人工肝透析和肝細(xì)胞移植，都有助于改善肝臟及全身微環(huán)境和生理狀況，有利于肝臟修復(fù)并恢復(fù)肝臟功能。這不僅有可能挽救中毒性急性肝衰竭，更重要的是對(duì)于一定程度的晚期肝病患者，能延緩或阻止進(jìn)入終末期肝衰竭。這兩種治療方法都需要用到大量的肝細(xì)胞。人原代肝細(xì)胞是理想的種子細(xì)胞，主要從不適合肝移植標(biāo)準(zhǔn)的肝臟中獲得。但是，原代肝細(xì)胞在體外不能培養(yǎng)擴(kuò)增，而且來(lái)源也受限于肝源供體短缺。近年來(lái)干細(xì)胞研究的前沿認(rèn)知及新技術(shù)的涌現(xiàn)，為這個(gè)突破帶來(lái)了新的契機(jī)。

人多能干細(xì)胞(Human pluripotent stem cells，hPSC)包括人胚胎干細(xì)胞(Humanembryonic stem cells，ESC)和人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(Human induced pluripotent stemcells，iPSC)，擁有的高度自我增殖能力和多向分化潛能，理論上可以誘導(dǎo)分化為人體所有類(lèi)型的細(xì)胞，包括成熟肝細(xì)胞。hPSC的肝系定向分化就是模擬體內(nèi)肝臟的發(fā)育過(guò)程，依次將其誘導(dǎo)為定型內(nèi)胚層細(xì)胞，肝祖細(xì)胞(Hepatoblasts，HBs)和成熟肝細(xì)胞。由hPSC大量制備臨床應(yīng)用的肝系供體細(xì)胞，還存在一定的困難，其主要障礙在于誘導(dǎo)hPSC肝系定向分化的效率較低，以及難以維持所獲的肝細(xì)胞在體外大量培養(yǎng)擴(kuò)增。尤其是后者，難于獲取所需要的大量肝細(xì)胞。臨床上肝細(xì)胞移植治療肝病，預(yù)計(jì)每次移植治療需要10⁹級(jí)肝細(xì)胞，而應(yīng)用于生物人工肝和藥物研發(fā)則需要更多的肝細(xì)胞。因此，快速高效的獲取大量的具有功能的肝細(xì)胞，應(yīng)用于細(xì)胞移植和生物人工肝透析等肝病治療具有重要意義。

在體外培養(yǎng)條件下，分化成熟的肝細(xì)胞難以長(zhǎng)期培養(yǎng)擴(kuò)增，并維持其固有的細(xì)胞特性。與之相比，HBs具有較強(qiáng)的增殖能力，同時(shí)具有快速向肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞分化的雙潛能。因此，規(guī)模化擴(kuò)增hPSC誘導(dǎo)分化來(lái)源的HBs，使其快速穩(wěn)定增殖，并保持良好的分化狀態(tài)，是獲取大量具有功能的肝細(xì)胞的理想方法。一方面可以?xún)龃鍴Bs，建立HBs庫(kù)，以便快速高效的獲取大量種子細(xì)胞；另一方面可以進(jìn)一步將HBs快速誘導(dǎo)分化為成熟的肝細(xì)胞或者膽管細(xì)胞；同時(shí)該方法可以為肝系細(xì)胞庫(kù)的建立提供可行的技術(shù)支持。

近幾年，有多個(gè)實(shí)驗(yàn)室相繼報(bào)道了擴(kuò)增HBs的相關(guān)研究。但是，這些研究報(bào)道大多以少數(shù)幾種HBs的標(biāo)志蛋白來(lái)評(píng)估擴(kuò)增后的HBs的雙潛能特性，而且缺乏很多相關(guān)的細(xì)胞功能評(píng)估。另外，部分HBs的擴(kuò)增方法的培養(yǎng)條件中采用了滋養(yǎng)層細(xì)胞，或者使用了胎牛血清等成分不明確的添加物。然而，將用于細(xì)胞治療的肝細(xì)胞污染有動(dòng)物血清、蛋白或者其他細(xì)胞時(shí)，常在臨床應(yīng)用中引起急性免疫排斥反應(yīng)及潛在的動(dòng)物病毒感染。因此，這樣培養(yǎng)獲取的肝細(xì)胞將不適合臨床應(yīng)用，這也是體外擴(kuò)增培養(yǎng)HBs時(shí)應(yīng)充分考慮的因素。

目前業(yè)內(nèi)尚未建立在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)擴(kuò)增HBs的有效方法，其難點(diǎn)在于hPSC向肝系細(xì)胞分化過(guò)程和調(diào)控機(jī)制還缺乏深入的了解，以及HBs增殖和干性維持的調(diào)控機(jī)理尚未清楚。