[發明專利]一種甘草發酵制備單葡萄糖醛酸甘草次酸的方法

有效

• 申請號: 201910073383.8
• 申請日: 2019-01-25
• 公開（公告）號: CN111485012B
• 公開（公告）日: 2023-06-09
• 發明（設計）人: 朱篤;張遷;肖依文;汪涯;高波良
• 申請（專利權）人: 江西科技師范大學
• 主分類號: C12P33/20
• 分類號: C12P33/20;C12N1/14;A23L27/10;A61K8/63;A61Q19/00;A61K47/28;C12R1/645
• 代理公司: 南昌大牛知識產權代理事務所(普通合伙) 36135
• 代理人: 孫林

本發明公開了一種通過固態發酵甘草制備單葡萄糖醛酸甘草次酸(GAMG)的方法，是一種以甘草為固態培養基主要成分，接入Chaetomium?globosumTHS3進行固態培養，發酵結束后甘草中甘草酸(GL)的轉化率可達90％以上，形成含GAMG和GL的混合物，可用于制備含GAMG的混合甜味劑或GAMG單體甜味劑，具有更高的甜度和溶解度。該方法直接以廉價、藥食同源的甘草為原料進行固態發酵，通過發酵產物的提取、分離純化和濃縮干燥，可獲得高產率和高純度GAMG，既不需要先提取分離得到GL，也不需要預先制備β?D?葡萄糖醛酸苷酶，即可制得目標產物，工藝步驟少、生產成本低、無污染，適合大規模生產。

技術領域

本發明涉及微生物工程領域，具體涉及一種通過固態發酵技術制備單葡萄糖醛酸甘草次酸的方法。

背景技術

由于過量食用糖容易導致齲齒、高血壓、糖尿病和其他疾病，因此尋找高甜度、低熱量以及安全的天然甜味劑成為人們的迫切需要。甘草為豆科(Leguminosae)甘草屬(Glycyrrhiza)植物，為我國重要藥食同源的傳統中草藥。被《中國藥典》認定的甘草藥材原植物有3種，即烏拉爾甘草、脹果甘草和光果甘草的根及根莖。目前，甘草提取物在全球廣泛被用作食品和飲料中的天然甜味劑，也被用作藥劑和膳食補充劑。甘草酸(GL)是甘草中的一種非常重要天然活性物質，其比普通食用糖(蔗糖)甜190倍，并被美國、歐盟和其他國家認為是安全的(GRAS)的甜味劑。此外，GL還具有許多藥理學活性，如抗病毒、抗氧化、抗癌和抗炎作用等，因此在功能性食品中具有廣闊的應用前景。但GL存在血液中吸收過低、過量攝入可能會干擾離子代謝平衡等問題，由此可能會對動物和人類造成一些不良影響。單葡萄糖醛酸甘草次酸(glycyrrhetinic?acidmonoglucuronide，簡稱GAMG)是通過專一性地水解GL的一個遠端葡萄糖醛酸轉化而成的，其甜度分別為GL、蔗糖的5倍和1000倍。與GL相比，GAMG具有更好的溶解度、更好的味道、更高的生物利用度、更強的生理活性以及更低的毒副作用(GAMG的LD₅₀為5000mg/kg，而GL的LD₅₀為805mg/kg)。近年來，由于GAMG有益的健康效果而被開發為新型的功能性甜味劑。

GAMG的制備方法主要包括化學法和生物法，而傳統的化學法制備GAMG，包括合成和水解兩種方法。例如，在Ag₂CO₃存在的條件下，甘草次酸(GA)與三乙酰溴代葡萄糖甲酯為反應物，生成了的其中一種中間物質經5％KOH的甲醇溶液作用后，生成了GAMG。但是，該方法的合成路線長、收率低，不能用于大量制備GAMG。而傳統的化學水解方法，對于GL中的兩個不同位置的糖苷鍵的選擇性低，可調控性差，不能實現GAMG的定向水解，因此，水解反應所得的GAMG產率也很低。與傳統的化學方法相比，生物法合成GAMG，具有操作簡單、反應條件溫和、鍵的選擇性強、反應速率快等優點。生物法在提高產品安全性、減少副產物形成和提高經濟可行性等方面優于化學法，并且正在成為食品和制藥行業中生產高價值生物活性化合物的常用方法。

生物法合成GAMG，是利用微生物菌體所產的β-D-葡萄糖醛酸苷酶(β-D-glucuronidase)水解GL結構上的β-1,2糖苷鍵，從而得到水解產物GAMG。目前生物轉化法無法滿足工業規模生產GAMG的原因主要包括以下幾個方面：(1)以GL為底物發酵，不僅價格較為昂貴，而且GL具有強極性和低水溶性，影響微生物對GL的消耗，從而限制了微生物細胞生長和酶的生產；(2)發酵過程中低生物量和酶產量導致GAMG產量低，嚴重限制了GAMG的工業規模應用；(3)只有少數酶具有GL水解活性，而能選擇性地去除GL的一個遠端葡糖醛酸而產生GAMG的酶更少，且很多會產生副產物GA，同時造成產物分離較為困難，限制了GAMG的工業規模生產。

綜上所述，GAMG是一種功能性甜味劑，具有巨大的開發價值。針對目前工業化生產GAMG存在的技術難點和瓶頸，我們先期獲得了多株高效制備GAMG的東鄉野生稻內生真菌。在此基礎上，本發明提供了一種甘草發酵制備GAMG的方法，可以有效降低生產成本，解決上述問題。

發明內容