[發明專利]水稻籽粒谷蛋白GluA2亞基的抗原表位、其抗體及應用

有效

• 申請號: 201910073042.0
• 申請日: 2019-01-25
• 公開（公告）號: CN109627306B
• 公開（公告）日: 2021-10-15
• 發明（設計）人: 朱嵐;何瑩;曾漢來;羅雅
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C07K16/16;G01N33/68
• 代理公司: 武漢智嘉聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 42231
• 代理人: 徐紹新

本發明公開了一種水稻籽粒谷蛋白GluA2亞基的抗原表位、抗水稻籽粒谷蛋白GluA2亞基的多克隆抗體及其制備方法與應用。所述水稻籽粒谷蛋白GluA2亞基的抗原表位具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。經過多肽合成，多肽與載體蛋白偶聯，免疫動物制得抗血清，并經過親和層析純化得到谷蛋白GluA2亞基多克隆抗體。本發明制備的多克隆抗體效價高、親和力強、特異性好，可與水稻谷蛋白GluA2亞基發生特異性結合反應，為谷蛋白基礎研究，如對其重要成員的特異性、表達譜和含量的分析，及其相關生理功能的研究提供了一個重要的工具。

技術領域

本發明屬于分子生物學和免疫學領域，具體涉及水稻籽粒谷蛋白家族GluA2亞基的抗原表位、特異性抗體及其制備方法和應用。

背景技術

按照經典Osborne的蛋白質分級提取理論，可將水稻籽粒貯藏蛋白(Seed storageprotein,SSP)分為4類：谷蛋白(Glutelin,Glu)、醇溶蛋白、球蛋白和水溶性的白蛋白。其中谷蛋白是稻米SSPs的主要組分，占籽粒中SSPs總含量的80％左右。在大多數谷物中SSPs的氨基酸組成存在賴氨酸含量不足，所以人們普遍認為賴氨酸是谷物SSPs營養水平上的第一限制性氨基酸。水稻籽粒蛋白質是公認的優質植物蛋白質，但對水稻籽粒蛋白質的結構和性質的研究相對較少。因此，水稻SSPs的組成以及優質SSPs組分的利用越來越成為稻米營養品質改良研究中的關注焦點。谷蛋白在水稻SSPs中均由多基因家族編碼，分別形成多個亞基的Glu家族和Pro家族。水稻基因組中存在15個Glu基因，其核酸序列相似性高達60％。根據序列同源性，Glu基因家族可以分為三個亞族GluA、GluB和GluC，同亞族中Glu成員之間的序列同源性約80％。亞族GluA中有4個成員GluA1、GluA2、GluA3和GluA4，其中GluA4為假基因；亞族GluB中有7個成員GluB1、GluB2、GluB3、GluB4、GluB5、GluB6和GluB7，其中GluB3為假基因；亞族GluC中，僅有1個成員GluC(曾命名為GluD-1)。

由于蛋白質家族的成員具有氨基酸序列高度同源或者分子量相似等特點，所以對蛋白家族成員進行蛋白分離和鑒定的研究存在一定難度。對水稻Glu家族而言，其亞基分離主要運用單向/雙向電泳技術(Sodium dodecyl sulfate/Two-dimension-polyacrylamidegel electrophoresis，SDS/2D-PAGE)和液相色譜技術(High performance liquidchromatography,HPLC)；Glu亞基在分離基礎上繼續運用質譜技術(Mass spectrometry,MS)和免疫雜交分析(Immunoblotting identification)進行蛋白鑒定。傳統的分離和鑒定技術過程復雜并且繁瑣，而在多克隆抗體制備過程中由于多個抗原決定簇的存在，重組蛋白的表達和純化過程中不可避免的會摻入一些雜蛋白，制備的抗體仍有可能存在交叉反應，從而影響抗體的特異性。蛋白質印記技術(Western Blot)利用抗原和抗體特異性結合來定性定量檢測復雜樣品中某目的蛋白，采用合成抗原表位的方法來制備抗體，即根據預測的抗原表位合成一段多肽作為抗原，多肽合成技術成熟，具有特異性好、靈敏度高、準確性高、操作簡便、結果直觀和成本低廉等優點，但其應用前提是必須具備特異性高的各組分抗體。

發明內容

本發明的第一個目的是提供水稻籽粒谷蛋白GluA2亞基的抗原表位及人工合成多肽抗原。

通過軟件預測了水稻籽粒谷蛋白GluA2亞基的特性(親水性、疏水性)及二級結構，得到多個抗原表位序列，綜合考慮多肽的長度等因素，確定了一條最有效的抗原表位。其氨基酸序列為TSQWQSSRRGSPRG(如SEQ ID NO:1所示)。