[發(fā)明專利]一種重組醛酮還原酶突變體及應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910072740.9
• 申請日: 2019-01-25
• 公開（公告）號: CN110004120B
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發(fā)明（設計）人: 王亞軍;喻寒;邱帥;程峰;鄭裕國
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12P13/00
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

本發(fā)明公開了一種重組醛酮還原酶突變體及在不對稱還原6?氰基?(5R)?羥基?3?羰基己酸叔丁酯制備6?氰基?(3R,5R)?二羥基己酸叔丁酯中的應用，重組醛酮還原酶突變體是將SEQ ID NO.2所示氨基酸第29位、28位進行單突變或多突變獲得的。本發(fā)明制備的醛酮還原酶突變體KmAKR?Y296W/W297H/K29H/Y28A的比酶活較對照組KmAKR?Y296W/W297提高了1.15倍，最大底物6?氰基?(5R)?羥基?3?羰基己酸叔丁酯投料量達到200g/L，底物轉(zhuǎn)化率大于99％，產(chǎn)物de_p值始終保持在99.5％以上。產(chǎn)物的濃度為549mM，時空產(chǎn)率達到670.5g/L d。

技術(shù)領域

本發(fā)明涉及醛酮還原酶KmAKR突變體構(gòu)建，開發(fā)醛酮還原酶重組菌和酶在阿托伐他汀側(cè)鏈6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯手性生物合成方面的應用。

背景技術(shù)

阿托伐他汀鈣(7-[2-(4-氟苯基)-3-苯基-4-(苯胺基甲酰基)-5-(2-丙基)吡咯-1-基]-3,5-二羥基庚酸鈣)屬于第三代合成他汀類藥物，鈣鹽的商品名具有高效的降脂功效，安全和長期臨床益處，可降低心腦血管疾病的發(fā)病率和死亡率。到目前為止，阿托伐他汀鈣的累計銷售額超過1000億美元，是制藥工業(yè)史上最成功的單一藥物品種。

6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯是阿托伐他汀鈣的關(guān)鍵手性二醇中間體，具有兩個手性中心，因此，研究光學純6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯的手性合成方法學和合成技術(shù)具有重要意義。已有的文獻報道6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯合成方法主要包括化學催化6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯不對稱還原和氧化還原酶差向選擇性還原6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯。化學催化劑硼烷催化還原存在能耗高，轉(zhuǎn)化率低，生產(chǎn)成本高等缺陷。與化學催化劑相比，酶具有更高效率的催化性能，生物還原具有立體選擇性高，副產(chǎn)物少，反應條件溫和，環(huán)境友好等優(yōu)點。

由于蛋白質(zhì)工程的發(fā)展，生物催化已廣泛應用于工業(yè)化生產(chǎn)。半合理設計是一種成熟的蛋白質(zhì)工程策略，利用蛋白質(zhì)序列、結(jié)構(gòu)和功能的信息，以及計算預測算法來預選有可能性的突變位點。在無法建立高通量篩選方法的情況下，半合理設計可以減少篩選工作量。因此，在本發(fā)明工作中，我們選擇半理性設計進行KmAKR改造。

我們從一株耐熱馬克斯克魯維酵母Kluyveromyces marxianus ZJB14056基因組中克隆出一種新的醛酮還原酶(KmAKR)編碼基因kmakr。通過定點突變技術(shù)獲得了一株優(yōu)勢突變株KmAKR-W297H/Y296W已在專利申請(201710282633.X)中公開，能夠在不添加外源型輔酶NADPH的情況下，4.5h內(nèi)完全轉(zhuǎn)化75g/L的底物，但發(fā)現(xiàn)該酶的活力和底物投料量還有提升空間突變體。因此，本發(fā)明借鑒已報道的醛酮還原酶晶體結(jié)構(gòu)信息，運用同源建模和分子對接技術(shù)手段，確定KmAKR-W297H/Y296W的空間結(jié)構(gòu)、酶活性中心附近的氨基酸位點，通過半理性設計提高醛酮還原酶對6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯的催化活力及底物投料量，構(gòu)建具有工業(yè)應用價值的突變酶及催化工藝。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是針對現(xiàn)有醛酮還原酶對6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯不對稱還原活性不高及底物投料量低的問題，提供一種立體選擇性醛酮還原酶突變體及利用該醛酮還原酶突變體基因重組菌及其粗酶液作為生物催化劑，用于6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯手性生物合成，催化劑活性提高1.15倍，底物投料量提高至200g/L。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種醛酮還原酶突變體，所述醛酮還原酶突變體是將SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第29位、28位進行單突變或多突變獲得的，優(yōu)選突變體為下列之一：(1)第29位賴氨酸突變?yōu)榻M氨酸或精氨酸；(2)第28位酪氨酸突變?yōu)楸彼峄蚪M氨酸；(3)第29位賴氨酸替換成組氨酸且第28位酪氨酸替換成丙氨酸。