[發明專利]通用型豬流行性腹瀉病毒和豬丁型冠狀病毒的雙重巢式RT-PCR引物及檢測方法與應用

有效

• 申請號: 201910071663.5
• 申請日: 2019-01-25
• 公開（公告）號: CN109868331B
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發明（設計）人: 劉國平;常小云;劉艷珍;劉夢杰;胡利群;曾攀
• 申請（專利權）人: 長江大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6848;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 武漢河山金堂專利事務所(普通合伙) 42212
• 代理人: 胡清堂

本發明提供了檢測豬流行性腹瀉病毒和豬丁型冠狀病毒的雙重巢氏RT?PCR引物、檢測方法及試劑盒。所述雙重巢氏RT?PCR引物是根據豬流行性腹瀉病毒和豬丁型冠狀病毒基因組的高度保守的N蛋白序列設計的四對引物。所述檢測方法包括：提取樣本RNA；以所得樣本RNA為模板，利用所述引物進行雙重巢式RT?PCR反應；反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。本發明提供的技術方案可同時檢測臨床樣本感染豬流行性腹瀉病毒和豬丁型冠狀病毒的情況，方便可靠、特異性強、靈敏度高、抗干擾性能好，而且與現有的核酸雜交、基因芯片等檢測方法相比成本較低，檢測周期短，實用性強。

技術領域

本發明屬于分子診斷技術領域，具體地說是一種通用型豬流行性腹瀉病毒和豬丁型冠狀病毒的雙重巢式RT-PCR引物及檢測方法與應用

背景技術

豬流行性腹瀉(Porcine Epidemic Diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的豬的一種急性腸道傳染病，以水瀉、嘔吐和脫水為特征。俗稱冬季拉稀病。其病原屬于冠狀病毒科冠狀毒病屬。豬流行性腹瀉病毒(PEDV)與豬丁型冠狀病毒(PDCoV)均為致病性冠狀病毒,可以引起豬嘔吐、腹瀉脫水和新生仔豬死亡。

PED屬于冠狀病毒科(Coronavirinae)冠狀病毒屬(coronavirus)，其基因組是具有感染性的單股正鏈RNA病毒，全長為28000左右，主要包括6個ORF，從5’—3’依次為編碼復制酶的多聚蛋白1ab(pp1ab)、纖突蛋白(S)、ORF蛋白、小膜蛋白(E)、膜糖蛋白(M)和核衣殼蛋白(N)的基因；

豬丁型冠狀病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)又稱豬德爾塔冠狀病毒，是冠狀病毒科(Coronavirinae)δ-冠狀病毒屬的成員。2010年入冬以來，我國各地豬場頻發新生仔豬腹瀉疫情，一般認為豬流行性腹瀉病毒流行毒株是主要致病病原，之后發現另一種新發冠狀病毒PDCoV也可導致仔豬腹瀉并在我國豬場廣泛存在。2014年初美國首次報道豬群該病的流行，此后至少有19個州有該新型冠狀病毒的報道。新型豬腸道冠狀病毒病可引起乳豬腹瀉和嘔吐，發病率和死亡率高達50％-100％，生長豬和成年豬感染后死亡率低。對養豬業的健康發展造成了一定的影響。

豬丁型冠狀病毒基因組的組成和排列與其它冠狀病毒類似。其基因組至少包括7個ORFs(開放閱讀框)，分別編碼四種結構蛋白(核蛋白N、小包膜蛋白E、纖突蛋白S和膜糖蛋白M)、兩種非結構蛋白(NS6和NS7蛋白)和兩種多聚蛋白(1a和1b蛋白)冠狀病毒是在已知RNA病毒的基因序列長度中最長的,但是豬丁型冠狀病毒的序列大小約為25.4kb，是所有冠狀病毒中基因組最小的。

而如何在提高其敏感性的基礎上解決上述技術問題，是目前亟待解決的問題。

發明內容

為了解決上述技術缺陷，本發明提供一種通用型豬流行性腹瀉病毒和豬丁型冠狀病毒的雙重巢式RT-PCR引物及檢測方法與應用；該方法中具有特異性強、靈敏度高的特點，適用于任何實驗室和基層各級防控單位、獸醫站及大中小型養殖場等，具有重要現實意義。

本發明第一方面提供一種通用型豬流行性腹瀉病毒和豬丁型冠狀病毒的雙重巢式RT-PCR引物，所述引物根據豬流行性腹瀉病毒和豬丁型冠狀病毒N基因中堿基序列設計四對特異性引物，分別為豬流行性腹瀉的外側引物PEDV-O和內側引物PEDV-I；豬丁型冠狀病毒的外側引物PDCoV-O和內側引物PDCoV-I，具體為：

PEDV-O-F：GCAAACGGGTGCCATTATCTC

PEDV-O-R：GCTCACGAACAGCCACATTAC

PEDV-I-F：TTGGCATTTCTACTACCTCGGAACA

PEDV-I-R：GCCTGACGCATCAACACCTTT

PDCoV-O-F：CAGGTCCCAGAGGAAATCTTA