[發明專利]通用型豬流行性腹瀉病毒和豬丁型冠狀病毒的雙重巢式RT-PCR引物及檢測方法與應用

有效

• 申請號: 201910071663.5
• 申請日: 2019-01-25
• 公開（公告）號: CN109868331B
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發明（設計）人: 劉國平;常小云;劉艷珍;劉夢杰;胡利群;曾攀
• 申請（專利權）人: 長江大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6848;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 武漢河山金堂專利事務所(普通合伙) 42212
• 代理人: 胡清堂

1.通用型豬流行性腹瀉病毒和豬丁型冠狀病毒的雙重巢式RT-PCR 引物，其特征在于：所述引物根據豬流行性腹瀉病毒和豬丁型冠狀病毒 N 基因中堿基序列設計四對特異性引物，分別為豬流行性腹瀉的外側引物 PEDV-O 和內側引物 PEDV-I；豬丁型冠狀病毒的外側引物 PDCoV-O 和內側引物 PDCoV-I，具體為：

PEDV-O-F：GCAAACGGGTGCCATTATCTC

PEDV-O-R：GCTCACGAACAGCCACATTAC

PEDV-I-F：TTGGCATTTCTACTACCTCGGAACA

PEDV-I-R：GCCTGACGCATCAACACCTTT

PDCoV-O-F：CAGGTCCCAGAGGAAATCTTA

PDCoV-O-R：TTTGGTAGGTGGCTCATAGGT

PDCoV-I-F：TGCCAAACGCAACCC

PDCoV-I-R：CAGCCATACCCGTCTTCT。

2.通用型豬流行性腹瀉病毒和丁型冠狀病毒的雙重巢式 RT-PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）、使用TrizolRNA提取液提取待測樣品RNA；

（2）、第一輪PCR 擴增：以S1 提取的RNA 為模板，利用權利要求 1 所述外側引物進行第一輪 PCR 擴增，對 PCR 擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，如果擴增出 996bp 和/或665bp 大小的目的條帶則證明為陽性，否則為陰性；

（3）、第二輪PCR擴增：以第一輪陰性的PCR擴增產物稀釋50倍為模板，利用權利要求 1所述內側引物進行第二輪 PCR 擴增，對PCR 擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，如果擴增出 749bp 和/或344bp 大小的目的條帶，則證明所述樣品中存在豬流行性腹瀉病毒和/或豬丁型冠狀病毒；

該方法不用于疾病的診斷和治療。

3.根據權利要求 2 所述方法，其特征在于：所述步驟（2）中，PCR 反應體系為：2×1Step Buffer 12.5 μ l，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1μ l，引物 20μ mol/L PEDV-O-F 和 PEDV-O-R、PDCoV-O-F 和PDCoV-O-R 各1μl，RNA 模板1μl，補加 RNase Free dH₂O至25μl。

4.根據權利要求 2 所述方法，其特征在于：所述步驟（2）中，PCR 的反應條件為：50℃反轉錄 30min，94℃預變性 2min，94℃變性30s，54℃退火 30s，72℃延伸 1min，32 個循環，72℃延伸 8min。

5.根據權利要求 2 所述方法，其特征在于：所述步驟（3）中， PCR 反應體系為：Mix12.5μ l，引物 20 μ mol/L PEDV-I-F、PEDV-I-R 和 PDCoV-I-F、PDCoV-I-R 各 1μ l，模板1μ l，補加 RNase Free dH₂O 至 25μ l 。

6.根據權利要求 2 所述方法，其特征在于：所述步驟（3）中，PCR 的反應條件為：94℃預變性 2min，98℃變性 30s，56℃退火 30s， 72℃延伸 50s，32 個循環，72℃延伸 8min。

7.權利要求 1 所述通用型豬流行性腹瀉病毒和豬丁型冠狀病毒的雙重巢式 RT-PCR引物在制備試劑盒中的應用。

8.根據權利要求 7 所述的應用，所述試劑盒還包括擴增試劑、陽性對照和陰性對照，所述陽性對照為含有豬流行性腹瀉病毒 996bp 和豬丁型冠狀病毒665bp 基因片段的重組質粒，所述陰性對照為RNase-free water。