[發明專利]一種佐匹克隆人工半抗原、人工抗原及其制備方法和應用有效
| 申請號： | 201910070891.0 | 申請日： | 2019-01-25 |
| 公開（公告）號： | CN109824673B | 公開（公告）日： | 2020-07-28 |
| 發明（設計）人： | 邵越水;王鎮 | 申請（專利權）人： | 杭州同舟生物技術有限公司 |
| 主分類號： | C07D487/04 | 分類號： | C07D487/04;C07K14/765;G01N33/53 |
| 代理公司： | 浙江千克知識產權代理有限公司 33246 | 代理人： | 黎雙華 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 克隆 人工 半抗原 抗原 及其 制備 方法 應用 | ||
1.一種佐匹克隆人工半抗原的制備方法，其特征在于，所述佐匹克隆人工半抗原的分子結構式如(Ⅰ)所示：
所述制備方法包括以下步驟：
(1)將6-(5-氨基-2-吡啶基)-6，7-二氫-7-羥基-5H-吡咯并[3，4-b]吡嗪-5-酮與二碳酸二叔丁酯和碳酸氫鈉按摩爾比1∶1～1.1∶1混合，加入體積比為4∶1的四氫呋喃和水的混合溶液，室溫下攪拌反應2～3小時，反應結束，將溶劑減壓蒸干，加入一定量的水，用1N的鹽酸調pH＝3，再用乙酸乙酯萃取，收集有機相，干燥過濾減壓蒸干得淡黃色油狀產物A；
(2)將淡黃色油狀產物A、4-甲基-1-哌嗪甲酰氯鹽酸鹽按摩爾比1∶1.5～2.0混合，加入吡啶溶解，在-10℃冰浴中攪拌反應3小時，然后緩慢升溫至室溫，減壓蒸干溶劑，倒入冰水，靜置析出固體，過濾，烘干得灰白色固體B；
(3)將灰白色固體B溶于體積比為1∶1的三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶液，室溫下攪拌反應16小時，結束反應，減壓蒸干溶劑，加入10％的碳酸鉀溶液，用6N的鹽酸調pH＝6，用二氯甲烷洗滌兩次，收集水相用1N的氫氧化鈉調pH＝10，再用二氯甲烷萃取，收集有機相，干燥、過濾、減壓蒸干得黃色油狀物C；
(4)將黃色油狀物C溶于無水乙醇中，置于0℃冰水浴中，再加入乙醇鈉和丙烯酸叔丁酯，室溫下攪拌反應18小時，結束反應，減壓蒸干溶劑，加入水溶解，用乙酸乙酯萃取，收集有機相，再分別用純化水和飽和的食鹽水洗滌，取有機相干燥、過濾、減壓蒸干得棕色油狀物D；
(5)將棕色油狀物D溶于體積比為1∶1的三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶液，室溫下攪拌反應16小時，結束反應，減壓蒸干溶劑，加入雙蒸水，加入碳酸鈉固體至沒有氣泡為止，用6N的鹽酸調pH＝6，用二氯甲烷洗滌兩次，收集水相用1N的氫氧化鈉調pH＝10，再用二氯甲烷萃取，收集有機相，干燥、過濾、減壓蒸干得棕色油狀物Ⅰ，即佐匹克隆人工半抗原。
2.一種佐匹克隆人工抗原的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：所述佐匹克隆人工抗原的分子結構式如(Ⅱ)所示：
所述制備方法包括以下步驟：
(1)將6-(5-氨基-2-吡啶基)-6，7-二氫-7-羥基-5H-吡咯并[3，4-b]吡嗪-5-酮與二碳酸二叔丁酯和碳酸氫鈉按摩爾比1∶1～1.1∶1混合，加入體積比為4∶1的四氫呋喃和水的混合溶液，室溫下攪拌反應2～3小時，反應結束，將溶劑減壓蒸干，加入一定量的水，用1N的鹽酸調pH＝3，再用乙酸乙酯萃取，收集有機相，干燥過濾減壓蒸干得淡黃色油狀產物A；
(2)將淡黃色油狀產物A、4-甲基-1-哌嗪甲酰氯鹽酸鹽按摩爾比1∶1.5～2.0混合，加入吡啶溶解，在-10℃冰浴中攪拌反應3小時，然后緩慢升溫至室溫，減壓蒸干溶劑，倒入冰水，靜置析出固體，過濾，烘干得灰白色固體B；
(3)將灰白色固體B溶于體積比為1∶1的三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶液，室溫下攪拌反應16小時，結束反應，減壓蒸干溶劑，加入10％的碳酸鉀溶液，用6N的鹽酸調pH＝6，用二氯甲烷洗滌兩次，收集水相用1N的氫氧化鈉調pH＝10，再用二氯甲烷萃取，收集有機相，干燥、過濾、減壓蒸干得黃色油狀物C；
(4)將黃色油狀物C溶于無水乙醇中，置于0℃冰水浴中，再加入乙醇鈉和丙烯酸叔丁酯，室溫下攪拌反應18小時，結束反應，減壓蒸干溶劑，加入水溶解，用乙酸乙酯萃取，收集有機相，再分別用純化水和飽和的食鹽水洗滌，取有機相干燥、過濾、減壓蒸干得棕色油狀物D；
(5)將棕色油狀物D溶于體積比為1∶1的三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶液，室溫下攪拌反應16小時，結束反應，減壓蒸干溶劑，加入雙蒸水，加入碳酸鈉固體至沒有氣泡為止，用6N的鹽酸調pH＝6，用二氯甲烷洗滌兩次，收集水相用1N的氫氧化鈉調pH＝10，再用二氯甲烷萃取，收集有機相，干燥、過濾、減壓蒸干得棕色油狀物Ⅰ，即佐匹克隆人工半抗原
(6)將步驟(5)獲得的佐匹克隆人工半抗原、N-羥基琥珀酰亞胺、二環己基碳二亞胺按摩爾比1∶1.35～1.5∶1.35～1.5混合于N，N-二甲基甲酰胺中，20～30℃下攪拌反應18小時，反應結束后離心取上清液；
(7)將上述上清液滴加到牛血清蛋白溶液中，混合液置于4℃下靜置過夜，經透析、離心取上清，獲得佐匹克隆人工抗原。
3.如權利要求2所述佐匹克隆人工抗原的制備方法，其特征在于，步驟(7)中，所述牛血清蛋白溶液的濃度為5mg/mL，上清液與牛血清蛋白溶液的體積比為1∶5。
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