[發明專利]一種佐匹克隆人工半抗原、人工抗原及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201910070891.0
• 申請日: 2019-01-25
• 公開（公告）號: CN109824673B
• 公開（公告）日: 2020-07-28
• 發明（設計）人: 邵越水;王鎮
• 申請（專利權）人: 杭州同舟生物技術有限公司
• 主分類號: C07D487/04
• 分類號: C07D487/04;C07K14/765;G01N33/53
• 代理公司: 浙江千克知識產權代理有限公司 33246
• 代理人: 黎雙華

本發明公開了一種佐匹克隆人工半抗原、人工抗原及其制備方法和應用。佐匹克隆人工半抗原的分子結構式如式(Ⅰ)，佐匹克隆人工抗原的分子結構式如式(Ⅱ)。所述應用是所述佐匹克隆人工抗原在制備抗佐匹克隆抗體中的應用。本發明的佐匹克隆人工半抗原最大程度地保留了佐匹克隆的特征結構，且具有可以與載體蛋白發生偶聯的活性基團，可作為抗原決定簇；進一步制備獲得的佐匹克隆人工抗原可免疫獲得親和力高、靈敏度高、特異性強的抗佐匹克隆抗體，經免疫新西蘭白兔獲得的免疫血清的效價高達1∶70000，可用于對佐匹克隆進行快速、準確的免疫檢測和免疫分析。

技術領域

本發明屬于生物化工技術領域，具體涉及一種佐匹克隆人工半抗原、人工抗原及其制備方法和應用。

背景技術

佐匹克隆(Zopiclone)作為第三代鎮靜催眠藥物，它既能夠縮短睡眠潛伏期、增加慢波睡眠、延長睡眠時間、提高睡眠質量以及睡眠深度、減少夜間覺醒和早醒次數，又不會引起精神運動性障礙。佐匹克隆具有抗焦慮、抗肌肉松弛和抗驚厥等作用，次日晨時殘余作用低，清醒后無宿醉反應，可用于各種原因引起的失眠，尤其適用于入睡困難和睡眠維持困難的患者。本品口服吸收快，半衰期為3.5～5小時，連續多次給藥無蓄積作用；具有高效、低毒、成癮性小的特點。

然而經調查報告顯示，服用佐匹克隆也會伴隨著一定的不良現象，比如服藥當夜會對患者造成不同程度的記憶損傷、運動損傷和行為損傷、次日思睡、次日神運動性損害、不同程度的藥物依賴和濫用、口苦、急性聞質性腎炎、致畸、乳汁中含量太高和中毒等。

目前，對佐匹克隆的檢測主要依靠高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、薄層色譜法(TLC)、質譜法(MS)等，但是存在儀器昂貴，檢測費時，并且需要專業技術人員進行操作，不能達到現代檢測對快速、準確的要求。因此建立快速、靈敏、準確的檢測技術是很有必要的。

免疫分析法可以彌補以上所有缺點，免疫分析法是一種利用抗原抗體特異性結合反應檢測各種物質(藥物、激素、蛋白質、微生物等)的分析方法，建立小分子化合物的免疫分析方法的關鍵是能夠制造出對小分子化合物具有高親和力和高特異性的抗體。但是，由于包括佐匹克隆在內的大多數小分子化合物(分子量小于1000)，不具有免疫原性，即缺乏T細胞表位而無法直接誘導動物機體產生特異性抗體，故小分子物質被稱為半抗原。通過適當的化學修飾，在半抗原分子結構的某個位置上帶上端部為活性基團的連接臂，再與大分子載體結合，生成半抗原-載體偶聯物(即人工抗原)，人工抗原可以借助T細胞表位來間接誘導B細胞的增殖和分化，繼而產生特異性抗體。

現有技術中還未有佐匹克隆人工半抗原、人工抗原的相關報道。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術中存在的缺陷與不足，提供一種佐匹克隆-牛血清蛋白人工抗原的制備方法，所制備的佐匹克隆-牛血清蛋白人工抗原可進行動物免疫，取得相應的佐匹克隆抗體，可用于各種佐匹克隆類免疫分析法的研究，為佐匹克隆的檢測提供更加方便快速準確的途徑。

本發明首先提供了一佐匹克隆人工半抗原，該佐匹克隆人工半抗原最大程度的保留了佐匹克隆的特征結構，且具有可以與載體蛋白發生偶聯的活性基團，可作為抗原決定簇。

一種佐匹克隆人工半抗原，其分子結構式如(Ⅰ)所示：

本發明公開了一種佐匹克隆人工半抗原的制備方法，該方法包括以下步驟：

(1)將6-(5-氨基-2-吡啶基)-6，7-二氫-7-羥基-5H-吡咯并[3，4-b]吡嗪-5-酮與二碳酸二叔丁酯和碳酸氫鈉按摩爾比1∶1～1.1∶1混合，加入體積比為4∶1的四氫呋喃和水的混合溶液，室溫下攪拌反應2～3小時，反應結束，將溶劑減壓蒸干，加入一定量的水，用1N的鹽酸調pH＝3，再用乙酸乙酯萃取，收集有機相，干燥過濾減壓蒸干得淡黃色油狀產物A；