[發明專利]檢測褐牙鲆卵殼前體蛋白的免疫熒光試劑盒及應用

有效

• 申請號: 201910070323.0
• 申請日: 2019-01-25
• 公開（公告）號: CN109884324B
• 公開（公告）日: 2021-07-30
• 發明（設計）人: 王軍;張振忠;汝少國;王蔚
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: G01N33/74
• 分類號: G01N33/74;G01N33/68;G01N33/533
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 張中南;邱岳

檢測褐牙鲆卵殼前體蛋白的免疫熒光試劑盒及應用。通過原核表達的方法制備褐牙鲆卵殼前體蛋白，免疫小鼠開發褐牙鲆卵殼前體蛋白多克隆抗體，并將FITC標記到純化的多克隆抗體上；由標記了FITC的褐牙鲆卵殼前體蛋白多克隆抗體構建檢測褐牙鲆卵殼前體蛋白的免疫熒光試劑盒。本發明不僅可用于檢測褐牙鲆魚體中卵殼前體蛋白的產生，還可以對卵殼前體蛋白在肝臟組織中的部位進行定位。與之前的免疫組化相比，本發明步驟較少，節約時間，檢測本底值底，為海洋環境雌激素的篩選、檢測和生態環境風險評價提供重要工具。

技術領域

本發明屬于環境檢測領域，具體涉及一種檢測褐牙鲆卵殼前體蛋白的免疫熒光試劑盒及應用。

背景技術

環境雌激素作為一類外源性化合物進入機體后，具有干擾體內正常分泌物質的合成、釋放、運轉、代謝、結合等過程，激活或抑制內分泌系統功能，從而破壞其維持機體穩定性和調控作用。近年來，環境中雌激素污染對自然環境的生態平衡及人類的健康構成了潛在的威脅,環境雌激素物質進入人體后，女性多出現子宮肌瘤、卵巢癌等疾病，男性多出現睪丸癌、精子的數量與質量下降等癥狀。低于1 ng/L的雌炔醇能導致雄性魟鱒產生雌魚特有的卵黃原蛋白，而4 ng/L的雌炔醇可導致幼魚的性畸形，其第二性征發生改變。海洋環境雌激素可導致魚類種群生存力和漁業資源下降。海洋環境雌激素污染日益嚴重，其中我國近岸海水中雌二醇、雌炔醇、雙酚A等常見雌激素的濃度達到45.7 ng/L、3.99 ng/L、3920ng/L。因此，為解決我國近海海域環境雌激素活性的檢測，亟需建立更靈敏、準確、簡便的檢測技術。

卵殼前體蛋白是近年來新發現的一種環境雌激素生物標志物，是一種雌性特異性蛋白，通常在雄魚和幼魚體內并不存在，但是在環境雌激素的誘導下能合成和分泌卵殼前體蛋白。通過檢測雄魚或幼魚體內的卵殼前體蛋白含量可以評價水體環境中的雌激素活性。與目前常用的環境雌激素生物標志物卵黃原蛋白相比，卵殼前體蛋白能更加敏感快速地對環境雌激素做出響應。1 ng/L E₂就能顯著上調雄性海洋青鳉(Oryzias javanicus)的肝臟卵殼前體蛋白基因表達水平，并且其相對表達量要明顯高于卵黃原蛋白的基因表達水平。因此，卵殼前體蛋白是環境雌激素篩選的更加敏感的生物標志物，然而目前國內外均未建立卵殼前體蛋白的檢測試劑盒，主要原因在于傳統的分離純化方法難以從魚體獲得卵殼前體蛋白，無法為免疫檢測技術的開發提供高純度的抗原，導致至今尚未建立卵殼前體蛋白的檢測方法，并且缺乏能對卵殼前體蛋白產生部位定位定量檢測的方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種檢測褐牙鲆卵殼前體蛋白免疫熒光試劑盒及其制備方法，以滿足現有技術的上述要求。

檢測褐牙鲆卵殼前體蛋白免疫熒光試劑盒，其特征在于該試劑盒裝有熒光素（FITC）標記的褐牙鲆卵殼前體蛋白1支。

上述檢測褐牙鲆卵殼前體蛋白免疫熒光試劑盒中，所述的FITC標記的褐牙鲆卵殼前體蛋白多克隆抗體是以如下方法制備：

1) 制備褐牙鲆卵殼前體蛋白純品；

2) 利用步驟1)得到的褐牙鲆卵殼前體蛋白純品制備褐牙鲆卵殼前體蛋白多克隆抗體；

3) 利用步驟2)得到的卵殼前體蛋白多克隆抗體制備FITC標記的卵殼前體蛋白多克隆抗體；

具體如下：

(1) 通過肌肉注射17β-雌二醇誘導褐牙鲆肝臟大量轉錄Chg H mRNA，用Trizol提取肝臟總RNA，經反轉錄獲得cDNA，以反轉后的cDNA為模版，利用引物F:CACCCAAGTTTTCAAGTCTCAGCAGTC，R:CCGCTTACTGAGCAGGGTCAATGAAT進行PCR擴增，回收目的片段；用T4連接酶將目的片段與pClone007載體連接后，將連接產物轉化至DH5α感受態細胞中，并進行測序，將測序正確的進行擴大培養，抽提質粒，以上述引物進行PCR擴增，切膠回收目的片段；