[發(fā)明專利]檢測褐牙鲆卵殼前體蛋白的免疫熒光試劑盒及應用

有效

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• 申請日: 2019-01-25
• 公開（公告）號: CN109884324B
• 公開（公告）日: 2021-07-30
• 發(fā)明（設計）人: 王軍;張振忠;汝少國;王蔚
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: G01N33/74
• 分類號: G01N33/74;G01N33/68;G01N33/533
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 張中南;邱岳

1.一種檢測褐牙鲆卵殼前體蛋白的免疫熒光試劑盒，其特征在于該試劑盒裝有FITC標記的褐牙鲆卵殼前體蛋白多克隆抗體1支；

所述的FITC標記的褐牙鲆卵殼前體蛋白多克隆抗體是用以下方法制備：

(1) 通過肌肉注射17β-雌二醇誘導褐牙鲆肝臟大量轉錄Chg H mRNA，用Trizol提取肝臟總RNA，經反轉錄獲得cDNA，以反轉后的cDNA為模版，利用引物F:CACCCAAGTTTTCAAGTCTCAGCAGTC，R:CCGCTTACTGAGCAGGGTCAATGAAT進行PCR擴增，回收目的片段；用T4連接酶將目的片段與pClone007載體連接后，將連接產物轉化至DH5α感受態(tài)細胞中，并進行測序，將測序正確的進行擴大培養(yǎng)，抽提質粒，以上述引物進行PCR擴增，切膠回收目的片段；

將回收的目的片段與pDE1表達載體連接后，將連接產物轉化至表達宿主菌BL21(DE3)；并將正確表達的宿主菌擴大培養(yǎng)，即加入終濃度為0.1 mM的IPTG，置于37℃恒溫搖床里震蕩培養(yǎng)10小時，將培養(yǎng)好的菌液5000 rpm 離心20 min，收集沉淀，經裂解液處理后，再次離心收集包涵體，向包涵體中加入30 mL溶解液，4℃攪拌過夜，所述溶解液為100 mM Tris，500 mM NaCl，10 mM咪唑，8 M尿素，pH8.0；將溶解后的包涵體10000 rpm 離心30 min，收集上清并過0.45 μm濾膜，采用鎳離子螯合磁珠純化，即獲得褐牙鲆卵殼前體蛋白純品；

(2) 利用得到的褐牙鲆卵殼前體蛋白純品免疫小鼠：將70 μg的卵殼前體蛋白純品和等體積的弗式完全佐劑乳化后注射入小鼠腹腔，兩周后用同樣劑量的卵殼前體蛋白純品與弗氏不完全佐劑充分乳化后對Balb/c小鼠進行加強免疫，一周后尾靜脈注射卵殼前體蛋白純品進行加強免疫，三天后取小鼠的血清，利用Protein G親和層析柱從腹水上清中純化獲得免疫球蛋白IgG；純化的抗體經PBS緩沖液透析24 h，即獲得褐牙鲆卵殼前體蛋白多克隆抗體；

(3) 將濃度為1 mg/mL純化的褐牙鲆卵殼前體蛋白多克隆抗體置于交聯(lián)反應液中4℃透析過夜，所述交聯(lián)反應液為7.56g NaHCO₃，1.06g Na₂CO₃，7.36g NaCl，1 L ddH₂O；按抗體：FITC=6：1的比例，稱取FITC，緩慢加入抗體溶液中以將FITC標記至抗體；邊加邊輕輕晃動使其與抗體混合均勻，暗處4℃反應8 h；用半飽和的硫酸銨將標記后的抗體沉淀分離，以除去未結合的熒光素，將交聯(lián)物在PBS中透析至透析液清亮，即獲得FITC標記的褐牙鲆卵殼前體蛋白多克隆抗體。

2.權利要求1所述的檢測褐牙鲆卵殼前體蛋白的免疫熒光試劑盒在海洋環(huán)境雌激素類物質檢測中的應用。