[發明專利]用于檢測罕見序列變體的組合物和方法

在審

• 申請號: 201910068812.2
• 申請日: 2014-12-11
• 公開（公告）號: CN109706222A
• 公開（公告）日: 2019-05-03
• 發明（設計）人: 林盛榕;孫朝輝;趙奇志;鄧凌鋒
• 申請（專利權）人: 安可濟控股有限公司
• 主分類號: C12Q1/6827
• 分類號: C12Q1/6827;C12Q1/6869;C12Q1/6874
• 代理公司: 北京安信方達知識產權代理有限公司 11262
• 代理人: 賀淑東

在一些方面，本發明提供了用于鑒定核酸樣品中的序列變體的方法。在一些實施方案中，方法包括鑒定測序讀取與參考序列之間的序列差異，以及將存在于至少兩個不同的環狀多核苷酸，如兩個具有不同接點的環狀多核苷酸中的序列差異判定為序列變體。在一些方面，本發明提供了可用于所述方法中的組合物和系統。

本申請是2014年12月11日提交的發明名稱為“用于檢測罕見序列變體的組合物和方法”的第201410765164.3號中國專利申請的分案申請。

交叉引用

本申請要求在2013年12月11日提交的美國臨時申請61/914,907、在2014年5月1日提交的美國臨時申請61/987,414和在2014年6月11日提交的美國臨時申請62/010,975的權益；上述所有美國臨時申請均通過引用并入本文。

背景技術

鑒定復雜群體內的序列變異是一個活躍發展的領域，特別是隨著大規模平行核酸測序的出現。然而，由于常用技術的固有誤差頻率比群體內許多實際序列變異的頻率更大，大規模平行測序具有顯著的局限性。例如，0.1-1％的誤差率已在標準的高通量測序中被報道。當變體頻率低，如等于或低于誤差率時，對罕見序列變體的檢測具有高的假陽性率。

檢測罕見序列變體的原因有很多。例如，檢測罕見特征性序列可用于鑒定和區分有害環境污染物如細菌分類群的存在。表征細菌分類群的常見方式是鑒定高度保守序列如rRNA序列的差異。然而，針對此的典型的基于測序的方法面臨與給定樣品中如此多數量的不同基因組和成員之間的同源性程度相關的挑戰，從而為本已繁瑣的程序呈現出復雜的問題。改進的程序將具有加強在多種設置下的污染檢測的潛力。例如，用于組裝衛星和其他空間飛行器的部件的潔凈室可使用本系統和方法進行勘測，以了解存在何種微生物群落，并且開發更好的去污染和清潔技術，從而防止將地球微生物引入其他星球或其樣品，或開發用來將由推定的地球外微生物產生的數據與由污染性地球微生物產生的數據進行區分的方法。食品監測應用包括對食品加工廠生產線的定期檢測，調查屠宰場，檢查餐廳、醫院、學校、監獄和其他機構的廚房和食品儲存區的食源性病原體。也可以類似地監測水源儲備和加工廠。

發明內容

鑒于以上所述，對改進的檢測罕見序列變體的方法存在需求。本發明的組合物和方法滿足了該需求，并且還提供了另外的益處。特別是，本發明的各個方面提供了對罕見或低頻核酸序列變體(有時稱為突變)的高度靈敏的檢測。這包括對在正常序列背景中可能含有少量變異序列的樣品中的低頻核酸變異(包括取代、插入和缺失)的鑒定和闡明，以及對在測序錯誤背景下的低頻變異的鑒定。

在一個方面，本發明提供了一種鑒定序列變體，例如核酸樣品中的序列變體的方法。在一些實施方案中，多個多核苷酸中的每個多核苷酸具有5’末端和3’末端，并且該方法包括：(a)將所述多個多核苷酸中的單獨多核苷酸進行環化以形成多個環狀多核苷酸，其中每個環狀多核苷酸在5’末端與3’末端之間具有接點(junction)；(b)擴增(a)的環狀多核苷酸；(c)對擴增的多核苷酸進行測序以生成多個測序讀取；(d)鑒定測序讀取與參考序列之間的序列差異；和(e)將存在于至少兩個具有不同接點的環狀多核苷酸中的序列差異判定(calling)為序列變體。在一些實施方案中，該方法包括鑒定測序讀取與參考序列之間的序列差異，以及將存在于至少兩個具有不同接點的環狀多核苷酸中的序列差異判定為序列變體，其中：(a)該測序讀取對應于該至少兩個環狀多核苷酸的擴增產物；且(b)該至少兩個環狀多核苷酸中的每一個包含通過連接相應多核苷酸的5’末端和3’末端而形成的不同的接點。