[發(fā)明專利]用于檢測罕見序列變體的組合物和方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201910068812.2
• 申請日: 2014-12-11
• 公開（公告）號: CN109706222A
• 公開（公告）日: 2019-05-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林盛榕;孫朝輝;趙奇志;鄧凌鋒
• 申請（專利權(quán)）人: 安可濟(jì)控股有限公司
• 主分類號: C12Q1/6827
• 分類號: C12Q1/6827;C12Q1/6869;C12Q1/6874
• 代理公司: 北京安信方達(dá)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11262
• 代理人: 賀淑東

1.一種鑒定包含多個(gè)多核苷酸的核酸樣品中的序列變體的方法，所述多個(gè)多核苷酸中的每個(gè)多核苷酸具有5’末端和3’末端，該方法包括：

(a)將所述多個(gè)多核苷酸中的單獨(dú)多核苷酸進(jìn)行環(huán)化形成多個(gè)環(huán)狀多核苷酸，其中每個(gè)環(huán)狀多核苷酸在5’末端與3’末端之間具有接點(diǎn)；

(b)擴(kuò)增(a)的環(huán)狀多核苷酸；

(c)對擴(kuò)增的多核苷酸進(jìn)行測序以生成多個(gè)測序讀取；

(d)鑒定測序讀取與參考序列之間的序列差異；以及

(e)將存在于至少兩個(gè)具有不同接點(diǎn)的環(huán)狀多核苷酸中的序列差異判定為序列變體。

2.一種鑒定序列變體的方法，該方法包括：鑒定測序讀取與參考序列之間的序列差異，以及將存在于至少兩個(gè)具有不同接點(diǎn)的環(huán)狀多核苷酸中的序列差異判定為序列變體，其中：

(a)所述測序讀取對應(yīng)于所述至少兩個(gè)環(huán)狀多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物；且

(b)所述至少兩個(gè)環(huán)狀多核苷酸中的每一個(gè)包含通過連接相應(yīng)多核苷酸的5’末端和3’末端而形成的不同的接點(diǎn)。

3.一種鑒定核酸樣品中的序列變體的方法，該核酸樣品包含少于50ng的多核苷酸，每個(gè)多核苷酸具有5’末端和3’末端，該方法包括：

(a)用連接酶環(huán)化所述樣品中的單獨(dú)的多核苷酸以形成多個(gè)環(huán)狀多核苷酸；

(b)一旦將所述環(huán)狀多核苷酸與所述連接酶分離，即擴(kuò)增所述環(huán)狀多核苷酸以形成多聯(lián)體；

(c)對所述多聯(lián)體進(jìn)行測序以生成多個(gè)測序讀取；

(d)鑒定所述多個(gè)測序讀取與參考序列之間的序列差異；和

(e)將從所述少于50ng多核苷酸的核酸樣品獲得的所述多個(gè)讀取中以0.05％或更高的頻率發(fā)生的序列差異判定為序列變體。

4.一種在反應(yīng)混合物中擴(kuò)增多個(gè)不同多聯(lián)體的方法，該多聯(lián)體包含靶序列的兩個(gè)或更多個(gè)拷貝，其中該靶序列包含以5’到3’方向取向的序列A和序列B，該方法包括對所述反應(yīng)混合物進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，其中該反應(yīng)混合物包含：

(a)多個(gè)多聯(lián)體，其中所述多個(gè)多聯(lián)體中的單獨(dú)的多聯(lián)體包含通過環(huán)化具有5’末端和3’末端的單獨(dú)多核苷酸而形成的不同的接點(diǎn)；

(b)包含序列A’的第一引物，其中該第一引物與靶序列的序列A通過序列A與序列A’之間的序列互補(bǔ)性特異性地雜交；

(c)包含序列B的第二引物，其中該第二引物與存在于包含靶序列互補(bǔ)體的互補(bǔ)多核苷酸中的序列B’通過序列B與B’之間的序列互補(bǔ)性特異性地雜交；和

(d)聚合酶，其延伸第一引物和第二引物以產(chǎn)生擴(kuò)增的多核苷酸；

其中靶序列的序列A的5’末端與序列B的3’末端之間的距離為75nt或更短。

5.一種在反應(yīng)混合物中擴(kuò)增多個(gè)包含靶序列的不同環(huán)狀多核苷酸的方法，其中該靶序列包含以5’到3’方向取向的序列A和序列B，該方法包括對所述反應(yīng)混合物進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，其中該反應(yīng)混合物包含：

(a)多個(gè)環(huán)狀多核苷酸，其中所述多個(gè)環(huán)狀多核苷酸中的單獨(dú)的環(huán)狀多核苷酸包含通過環(huán)化具有5’末端和3’末端的單獨(dú)多核苷酸而形成的不同的接點(diǎn)；

(b)包含序列A’的第一引物，其中該第一引物與靶序列的序列A通過序列A與序列A’之間的序列互補(bǔ)性特異性地雜交；

(c)包含序列B的第二引物，其中該第二引物與存在于包含靶序列互補(bǔ)體的互補(bǔ)多核苷酸中的序列B’通過序列B與B’之間的序列互補(bǔ)性特異性地雜交；和

(d)聚合酶，其延伸第一引物和第二引物以產(chǎn)生擴(kuò)增的多核苷酸；

其中序列A和序列B是內(nèi)源性序列，并且靶序列的序列A的5’末端與序列B的3’末端之間的距離為75nt或更短。