[發明專利]基于細胞外衍生基質修飾的絲素蛋白多孔支架的制備方法

在審

• 申請號: 201910066736.1
• 申請日: 2019-01-24
• 公開（公告）號: CN109793927A
• 公開（公告）日: 2019-05-24
• 發明（設計）人: 周瑾;劉偉;王常勇;朱惠敏;王春蘭
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
• 主分類號: A61L27/22
• 分類號: A61L27/22;A61L27/38;A61L27/56
• 代理公司: 北京華仲龍騰專利代理事務所(普通合伙) 11548
• 代理人: 李靜

本發明公開了屬于生物材料技術領域的一種基于細胞外衍生基質修飾的絲素蛋白多孔支架的制備方法。本發明利用心肌成纖維細胞對絲素蛋白多孔支架進行修飾，得到的支架材料表面具有細胞外基質組份，同時DNA殘留低于5%，并且該支架材料具有良好的生物相容性，為工程化心肌組織的體外構建提供了良好的支架材料。

技術領域

本發明屬于生物材料技術領域，具體涉及一種基于細胞外衍生基質修飾的絲素蛋白多孔支架的制備方法。

背景技術

支架材料是種子細胞粘附和生長的基礎，也是心肌組織工程基礎。支架材料的特性和結構決定著工程化組織的形態與功能。與骨、軟骨、皮膚等組織不同，心臟的組織結構較為復雜，其對支架材料的理化特性要求更高。近年來，基于仿心肌細胞外組份、取向結構、力學、電生理特性的支架材料構建更具仿生特性的心肌組織研究進展迅速，進一步利用天然心肌的微環境結構特點，研發基于仿心肌細胞外基質組份及微結構的支架材料構建工程化心肌組織受到廣泛關注，目前有報道利用膠原、全器官脫細胞基質等天然細胞外基質組份構建工程化心肌組織備受關注。

細胞衍生細胞外基質材料作為天然生物材料的一種，是利用化學試劑、物理凍融等方法對細胞進行脫細胞基質，從而獲得沒有細胞核存留，但具有天然細胞外基質(ECM)特性的生物支架材料。這種細胞衍生的細胞外基質材料的優點在于，與組織來源的ECM支架相比，細胞衍生的ECM基質由于其培養及擴增時可有效排除病原體污染。其可以保持良好的天然細胞外基質成分，且這種細胞衍生的ECM基質可保留細胞原有的印跡，對再接種細胞具有一定的調控作用。同時，與組織來源的ECM支架相比，細胞衍生的細胞外ECM可塑性強，可對其他材料進行有效的修飾。但是這種細胞衍生的ECM材料也存在一定程度的缺點，如在脫細胞的過程中涉及的物理和化學方法可能使原有的細胞中因子流失，細胞衍生的基質與組織衍生的基質相比較少等。心肌成纖維細胞(CFs)約占正常心肌組織細胞總數的60％-70％，其廣泛存在于心臟組織中，包繞心肌細胞。心肌成纖維細胞分泌的細胞外基質作為心臟基質的重要組成部分，其與心臟發育、結構、細胞信號系統、電機械功能等密切相關。因此，心肌成纖維細胞衍生的基質材料作為提供細胞生長的重要微環境因素受到廣泛關注。已有研究報道，Gu等人通過用施旺細胞衍生的ECM與殼聚糖材料重建新型支架，用于組織工程神經修復。而目前細胞衍生細胞外基質用于心肌組織構建的研究尚未見報道。

蠶絲來源于家蠶繭，是一種被廣泛使用和研究的蛋白質聚合物的生物材料。蠶絲分為絲膠蛋白和絲素蛋白，其中絲素蛋白為主要成分，約占到70-80％。絲素蛋白在形成不同材料時具有顯著的機械性能，表現出較好的生物相容性，具有可控的降解速率，并且可以通過化學改性以改變表面性質或固定生長因子。目前研究可從蠶繭中提取絲素蛋白以研制水凝膠，海綿支架，纖維支架，微球和薄膜等。絲素蛋白材料可直接用作體內植入物，可作為組織工程和體外疾病研究模型中的支架，以及用于藥物遞送等。David L.Kaplan團隊已利用絲蛋白多孔支架體外成功構建出脂肪組織、腎組織、軟骨組織以及腦皮層組織。Shoei-Shen Wang等也利用絲素蛋白多孔支架攜帶骨髓間充質干細胞進行大鼠心梗修復研究，也取得了良好的效果，證實復合物可以有效提高移植細胞在心梗區的滯留和存活。然而，絲素蛋白支架存在材料組份單一，不具有細胞外基質組份微環境組份，仿生能力不足的問題。

發明內容

本發明的目的在于提出一種基于細胞外衍生基質修飾的絲素蛋白多孔支架的制備方法。

為實現上述技術目的，本發明采取了如下的技術方案：

一種基于細胞外衍生基質修飾的絲素蛋白多孔支架的制備方法，將心肌成纖維細胞接種到絲素蛋白支架材料上進行培養，得到修飾后的絲素蛋白多孔支架。

上述多孔支架的制備方法，按照如下步驟進行：

S1.絲蛋白預處理，方法如下：將蠶繭剪碎并放入質量分數為17％的煮沸的碳酸鈉水溶液中煮30分鐘，取出冷卻并擠出水分，然后用水漂洗絲蛋白20 分鐘，取出后通風干燥；