[發明專利]基于細胞外衍生基質修飾的絲素蛋白多孔支架的制備方法

在審

• 申請號: 201910066736.1
• 申請日: 2019-01-24
• 公開（公告）號: CN109793927A
• 公開（公告）日: 2019-05-24
• 發明（設計）人: 周瑾;劉偉;王常勇;朱惠敏;王春蘭
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
• 主分類號: A61L27/22
• 分類號: A61L27/22;A61L27/38;A61L27/56
• 代理公司: 北京華仲龍騰專利代理事務所(普通合伙) 11548
• 代理人: 李靜

1.一種基于細胞外衍生基質修飾的絲素蛋白多孔支架的制備方法，其特征在于，將心肌成纖維細胞接種到絲素蛋白支架材料上進行培養，得到修飾后的絲素蛋白多孔支架。

2.根據權利要求1所述基于細胞外衍生基質修飾的絲素蛋白多孔支架的制備方法，其特征在于，按照如下步驟進行：

S1. 絲蛋白預處理：將蠶繭剪碎并放入質量分數為17%的煮沸的碳酸鈉水溶液中煮30分鐘，取出冷卻并擠出水分，然后用水漂洗絲蛋白20分鐘，取出后通風干燥；

S2. 制備絲蛋白溶液：將干燥的絲蛋白溶于20%的9.3M溴化鋰溶液中，60℃條件下溶解4小時，得到20%的絲素蛋白，透析2天，然后于在4℃9000rpm條件下離心20分鐘，取出于4℃保存；

S3. 制備絲蛋白支架： 將絲素蛋白溶液加入模具中，并撒上鹽顆粒凝膠化1-2天，將凝膠化的絲蛋白支架于蒸餾水浸泡去鹽后進行高壓滅菌；

S4. 分離心肌成纖維細胞：取新生1天齡SD大鼠，開胸，取心臟，置于預冷的PBS液體中，剪碎，并利用0.05%胰酶反復消化直至組織塊消化完全，1000rpm/7分鐘離心，獲得細胞沉淀，于高糖DMEM加15%胎牛血清中重懸并接種在培養皿上，1小時后棄去未貼壁的心肌細胞，獲得原代心肌成纖維細胞；并利用高糖-DMEM加10%胎牛血清培養基培養心肌成纖維細胞至85-90%融合后消化；

S5. 心肌成纖維細胞修飾絲素蛋白：將消化好的心肌成纖維細胞接種在支架材料上，接種密度為1×10⁷個/ml，每個支架接種30μl，利用高糖-DMEM加10%胎牛血清培養基培養10天，得到細胞外衍生基質修飾的絲素蛋白支架。