[發明專利]一種奧曲肽偶聯的納米殼聚糖分子信標的制備方法

在審

• 申請號: 201910065784.9
• 申請日: 2019-01-24
• 公開（公告）號: CN109985250A
• 公開（公告）日: 2019-07-09
• 發明（設計）人: 朱海振;黃立敏;王姿;郭熠;朱海燕;胡建軍;候凈;楊飛月;蔣瑩;思雪瑩;江飛龍
• 申請（專利權）人: 貴州省人民醫院
• 主分類號: A61K49/00
• 分類號: A61K49/00;A61K47/61;A61K38/08;A61P35/00
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

本發明的用于肺癌早期診斷和治療的奧曲肽(OCT)偶聯的納米殼聚糖(CS)分子信標(MB)，首先自組裝法合成納米殼聚糖分子信標(CS?MB)，然后通過化學反應以戊二醛為交聯劑合成奧曲肽偶聯的納米殼聚糖分子信標(CS?MB?OCT)，該CS?MB?OCT納米復合物能夠根據熒光強度動態監測肺癌的發生、發展過程，同時奧曲肽本身或此復合物通過與腫瘤細胞高表達的microRNA結合進一步抑制microRNA的表達，從而達到抑瘤目的，可應用于肺癌細胞、肺癌裸鼠肺移植瘤及早期肺癌轉基因小鼠模型活體動物成像，具有靶向性強、轉染效率高、特異性高、穩定性好、背景低、抑瘤率高等特點，將為肺癌的早期診斷和治療提供新思路、新方法和新技術。

技術領域

本發明涉及生物醫藥技術領域，尤其涉及一種用于肺癌診斷和治療 的奧曲肽偶聯的納米殼聚糖分子信標的制備方法。

背景技術

肺癌是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，其發病率和死亡率逐年攀 升，早期診斷及早治療是改善患者預后的關鍵，但是肺癌患者在病變早 期往往無明顯癥狀，就診時大多為中晚期，喪失了治療的最佳時機。因 此從肺癌發生的“起源”著手，探尋高效、特異的早期診斷及治療的新方 法，將會對肺癌的預防、診斷及治療產生深遠的影響。

腫瘤干細胞理論認為在腫瘤組織細胞中存在一群數量極少的腫瘤 細胞，稱為腫瘤干細胞，所有的腫瘤細胞都是由腫瘤干細胞分化來的。 微小RNA(miRNA，microRNA)在腫瘤的發生發展過程中發揮重要作用， 檢測NSCLC干細胞相關的miRNAs是肺癌早期診斷和治療的一個重要策 略。研究表明常見的不同腫瘤類型呈現特征性的miRNAs表達譜，這將 為腫瘤的組織來源和診斷提供依據，特征性的miRNA表達譜可以作為 腫瘤早期診斷和治療的分子標志物，也可判斷不同腫瘤的預后、預測治 療效果。多項研究顯示miR-155在NSCLC中高表達，檢測肺組織內的 miR-155表達水平能區分肺癌患者與非肺癌患者，而且檢測腫瘤組織內 的miR-155表達水平能預測患者的腫瘤復發和不良預后風險，肺癌干細 胞中miR-155表達高于普通肺癌細胞。如果能夠直接攜帶熒光物質或化 療藥物靶定肺癌細胞甚至肺癌干細胞，將有望最終達到早期診斷和根治 肺癌的目的。分子信標(molecular beacon，MB)是基于熒光共振能量轉 移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)原理設計的一種高靈敏性 和高特異性檢測工具，實際上是一種呈莖環結構的雙標記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對。未結合目標鏈時，位于其末端的熒光基 團與淬滅基團緊緊靠近，熒光被淬滅；當分子信標與目標鏈結合時，分 子信標的空間構象發生改變，熒光基團遠離猝滅基團，熒光信號恢復， 因此分子信標是一種特異性檢測DNA和RNA靶向序列的發夾型核酸探 針，可被用來進行核酸-核酸和活細胞內可視化研究。

常規分子信標本身易被核酸酶或核結合蛋白降解，存在穩定性差、 細胞攝取困難等缺點。而用鎖核酸(1ocked nucleic acid，LNA)修飾堿基， 由于幾何和立體性質改變，其在較高溫度的環境中能穩定存在，抗核酸 酶降解的能力顯著增強，具有與DNA/RNA強大的雜交親和力。利用分 子信標的關鍵是如何獲得理想的轉運載體，既可有效地保護免于被降解，又可高效地將分子信標遞送入宿主細胞發揮靶向識別核酸序列的功 能。殼聚糖(chitosan，CS)納米為天然陽離子多糖，體外及體內實驗均 證實了殼聚糖作為轉移載體的安全性及有效性，其主要特點有：①組織 相容性好、免疫原性低，毒性小；②荷正電，易與DNA分子自組裝結合 成納米復合物，形成穩定的核殼結構，且對DNA有保護作用；③制作過程簡單、溫和，對DNA、抗體等生物大分子理化性質影響??；④殼聚糖 納米表面密集的活性氨基基團便于大分子修飾和耦聯。