[發明專利]一種檢測EGFR基因外顯子19缺失突變的試劑盒及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201910065447.X
• 申請日: 2019-01-24
• 公開（公告）號: CN109825580A
• 公開（公告）日: 2019-05-31
• 發明（設計）人: 宋興國;宋現讓;謝麗
• 申請（專利權）人: 宋興國
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6858;C12Q1/6851
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 李桂存

本發明涉及生物醫學核酸檢測試劑盒技術領域，具體為檢測表皮生長因子受體EGFR基因外顯子19缺失突變的試劑盒，包括PCR擴增引物、Taq?man探針、數字PCR預混液、微滴生成油、陰性對照和陽性對照。所述的標記Taq?man探針和PCR擴增引物可以用于制備試劑盒，基于數字PCR平臺用來檢測EGFR外顯子19缺失突變，為靶向治療篩選患者提供參考，也可用于癌癥患者，特別是肺癌患者的高靈敏度早期復發監測，以及用藥期間耐藥性突變監測，且價格低廉，操作簡單。

技術領域

本發明涉及生物醫學核酸檢測試劑盒技術領域，具體為檢測表皮生長因子受體EGFR 基因外顯子19缺失突變的試劑盒及其制備方法和應用。

背景技術

隨著個體化醫療觀念的不斷深入，檢測特定基因的特定位點突變已經成為指導靶向治療用藥的先決條件。酪氨酸激酶抑制劑(TKI)是近年來肺部腫瘤治療的熱點靶向藥物，與傳統放化療藥物相比，可明顯延長腫瘤患者生存期，改善生存質量。

EGFR(epidermal growth factor receptor，EGFR)是表皮生長因子受體(HER)家族成員之一。EGFR已成為近年來腫瘤治療研究和抗腫瘤藥物篩選的熱點，有關EGFR突變與腫瘤發生以及EGFR突變在分子靶向治療中的作用日益受到人們的關注。EGFR突變是癌癥患者是否對TKI敏感的強預測因子，因此EGFR基因突變的檢測能為腫瘤靶向治療提供依據。

EGFR的突變主要發生在胞內TK區域的前四個外顯子上(18～21)，目前發現的TK區域突變有30多種。其中90％的突變位于19和21區的外顯子，稱為經典型突變，外顯子 18和20突變約占10％。外顯子19的突變主要是第746-750位密碼子(ΔE746-E750)缺失突變，導致其相應的氨基酸序列丟失。外顯子19缺失突變占約46％，主要是發生9、12、 15、18、24個核苷酸的框內缺失突變。因此EGFR外顯子exon19缺失突變的檢測，可以為篩選靶向治療患者提供參考；同時可用于癌癥患者，特別是肺癌患者的高靈敏度早期復發監測，以及用藥期間耐藥性突變監測。

目前基因變異的檢測技術主要有直接測序法(亦稱Sanger測序法)和ARMS法。現分別簡介于下：

測序法是目前進行EGFR突變檢測的可靠方法，也是使用最多的方法。測序法需要對測序樣品擴增、純化、序列分析，過程比較繁瑣、耗時長，且對取材和技術要求比較高；聚合酶鏈式反應－單鏈構象多態性分析(PCR-SSCP)PCR-SSCP是一種比較經典的基因突變檢測的方法，該方法可以對未知的突變進行檢測。與測序法相比，PCR-SSCP靈敏性更高，操作簡單，無需特殊儀器，還可以對未知的突變進行檢測；ARMS法也稱擴增阻礙突變系統(Amplification Refractory Mutation System，ARMS)、等位基因特性PCR(AlleleSpecific PCR，ASPCR)等，即等位基因特異性擴增法(Allele Specific Amplification，ASA，選擇性地擴增野生型或突變型基因。

上述現有技術存在以下問題：價格昂貴，操作復雜，且一般需要通過有創性組織活檢，且不易重復獲取。研究表明，在血液、胸腔積液、唾液、糞便等樣本中，會有少量混雜于大量野生型基因組DNA中的突變腫瘤細胞DNA。從這些低含量樣本中檢測突變的基因，需要找一種靈敏性高、特異性強、簡便易行、結果判定簡單的突變檢測方法，用于癌癥患者，特別是肺癌患者的靶向用藥指導、高靈敏度早期復發監測，以及用藥期間耐藥性突變監測等。

發明內容

針對現階段檢測EGFR基因外顯子19缺失突變的方法中存在的問題，本發明提供了一種價格低廉，操作簡單，可一次性測定八種突變的檢測試劑盒及其方法，為個體化用藥提供參考。

本發明技術方案如下：

一種檢測EGFR外顯子19缺失突變的試劑盒，包括PCR擴增引物、Taq-man探針、數字 PCR預混液、微滴生成油、陰性對照和陽性對照。