[發明專利]一種檢測EGFR基因外顯子19缺失突變的試劑盒及其制備方法和應用在審
| 申請號： | 201910065447.X | 申請日： | 2019-01-24 |
| 公開（公告）號： | CN109825580A | 公開（公告）日： | 2019-05-31 |
| 發明（設計）人： | 宋興國;宋現讓;謝麗 | 申請（專利權）人： | 宋興國 |
| 主分類號： | C12Q1/6886 | 分類號： | C12Q1/6886;C12Q1/6858;C12Q1/6851 |
| 代理公司： | 濟南泉城專利商標事務所 37218 | 代理人： | 李桂存 |
| 地址： | 250117 山東省濟南市槐*** | 國省代碼： | 山東;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 缺失突變 外顯子 數字PCR 試劑盒 表皮生長因子受體 核酸檢測試劑盒 制備方法和應用 制備試劑盒 耐藥性 靶向治療 復發監測 高靈敏度 生物醫學 陽性對照 陰性對照 生成油 預混液 種檢測 檢測 可用 微滴 肺癌 突變 癌癥 篩選 參考 監測 | ||
1.一種檢測EGFR外顯子19缺失突變的試劑盒，其特征在于，包括PCR擴增引物、Taq-man探針、數字PCR預混液、微滴生成油、陰性對照和陽性對照；
所述的PCR擴增引物，包括反向PCR擴增引物和正向PCR擴增引物；用于擴增含有EGFR外顯子19上c.2204-c.2335序列的片段；所述的EGFR外顯子19上c.2204-c.2335的序列如SEQNo.1所示；
所述的Taq-man探針包括位點探針及參考探針；
所述的參考探針序列如SEQ No.2所示；
所述的位點探針序列如SEQ No.3所示；
所述的位點探針及參考探針的5’端連接有熒光基團，3’端連接有猝滅基團。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的熒光基團選自6-羧基熒光素、六氯-6-羧基熒光素、FAM、Cy5、Cy3或VIC；所述的猝滅基團選自6-羧基四甲基若丹明、BHQ1、BHQ2或MGB。
3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的反向PCR擴增引物和正向PCR擴增引物包括上游引物及下游引物，所述的上游引物序列如SEQ No.4所示：
所述的下游引物序列如SEQ No.5所示。
4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的數字PCR預混液包括Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl2、PCR buffer、PCR反應增強劑、穩定劑。
5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的上游引物和下游引物的使用濃度為5 μM~15 μM，在最終反應體系中的濃度為400 nM~1200 nM。
6.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的位點探針和參考探針的使用濃度為5 μM~25 μM，在最終反應體系中的濃度為100 nM~500 nM。
7.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的陰性對照來源于攜帶EGFR基因19外顯子野生型非小細胞肺癌細胞A549；所述的陽性對照來源于攜帶EGFR基因19外顯子缺失突變的陽性細胞非小細胞肺癌細胞HCC827、H1650或PC9。
8.一種權利要求1所述的試劑盒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
（1）DNA提取：提取含有EGFR基因19外顯子缺失突變的陽性細胞非小細胞肺癌細胞HCC827、H1650或PC9和EGFR基因野生型細胞A549的基因組DNA；
（2）數字PCR反應液制備；
（3）PCR反應微滴制備：將PCR反應液轉移至微滴發生卡，在油孔中加入微滴生成油，制備微滴；
（4）PCR擴增：退火后，然后擴增反應；
（5）檢測及計算突變率。
9.根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（2）包括：將待檢測樣品、PCR擴增上下游引物、無酶水、EGFR基因19外顯子缺失的位點探針和參考探針以及數字PCR預混液混合制備得到數字PCR混合液。
10.一種權利要求1所述的試劑盒在血漿、血清中檢測EGFR-19外顯子缺失的應用。
11.一種權利要求1所述的試劑盒在唾液中檢測EGFR-19外顯子缺失的應用。
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