[發明專利]一種溶解性多糖單加氧酶酶活的檢測方法及其應用

在審

• 申請號: 201910064696.7
• 申請日: 2019-01-23
• 公開（公告）號: CN109884004A
• 公開（公告）日: 2019-06-14
• 發明（設計）人: 馬江鋒;成超;姜岷
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務所 32230
• 代理人: 徐蓓

本發明涉及一種溶解性多糖單加氧酶的檢測方法及其應用。其檢測原理為以10?乙酰基?3,7?二羥基吩噁嗪作為底物，辣根過氧化物酶作為輔酶，當溶解性多糖單加氧酶和氧氣反應生成過氧化氫時，在輔酶的作用下，和底物反應生成具有熒光的試鹵靈。該檢測方法不需要額外添加電子供體，提高了反應的穩定性，可用于未純化產物鑒定，靈敏度高，且檢測時間短。利用熒光檢測方法檢測溶解性多糖單加氧酶酶活還具有檢測通量高、準確性高、易于實現自動化、成本低等特點，有利于在篩選工作中進行規模化應用，與流式細胞儀結合使用，可高效快速的篩選到具有高酶活的優良菌種。

技術領域

本發明屬于生物學技術領域，具體涉及一種溶解性多糖單加氧酶酶活的檢測方法及其應用。

背景技術

溶解性多糖單加氧酶 （lytic polysaccharide monooxygenases，LPMO）是一類作用于結晶多糖的氧化酶，其能夠通過氧化作用來斷裂幾丁質（或纖維素）的糖苷鍵，生成氧化的糖鏈末端和新的非還原糖鏈端，使得結晶底物的結構趨于松散，為之后的糖苷水解酶進一步作用提供基礎。目前已知的 LPMO 主要分布于 AA9 和 AA10 兩個蛋白質家族，其中AA9 家族的 LPMO 全部是作用于纖維素底物的，而 AA10 家族的 LPMO 則有些是作用于纖維素底物，有些是作用于幾丁質底物。溶解性多糖單加氧酶（LPMO）的發現不僅揭示出生物質降解過程中的新模式，而且也為高效降解生物質提供新思路。

傳統的檢測溶解性多糖單加氧酶活性的方法，多為直接作用于纖維素，通過液相及液質進行檢測，不適合非純化的樣品和大規模的分析檢測，且耗時耗力和成本昂貴。所以開發簡單快速、靈敏度高、特異性好的溶解性多糖單加氧酶酶活檢測手段是必要的，這對溶解性多糖單加氧酶的推廣應用也具有重大意義。熒光檢測提供了新的檢測酶活的方法，基于生物傳感器能夠準確、快速地檢測酶的活性，由于其獨特的光學特性，引起了特別的關注。

目前，基于熒光檢測已經成功應用于溶解性多糖單加氧酶酶活的檢測。但該方法需要通過抗壞血酸鹽等電子供體，而抗壞血酸鹽及其不穩定，且該方法不適合非純化的樣品。因此開發出可以直接檢測非純化，不受電子供體影響的熒光檢測方法是必要的。

發明內容

為了克服現有技術的不足，本發明的目的是提供一種簡單快速、高靈敏度的溶解性多糖單加氧酶酶活檢測方法及其應用。通過該檢測方法可以更好的滿足檢測過程中快速、低成本的精確性檢測需求。

為實現發明目的，本發明采用如下技術方案：

一種溶解性多糖單加氧酶酶活的檢測方法，其特征在于，底物10-乙酰基-3,7-二羥基吩噁嗪和輔酶辣根過氧化物酶混合，加入溶解性多糖單加氧酶后檢測熒光放射強度變化。

所述的溶解性多糖單加氧酶酶活的檢測方法，具體包括如下步驟：

（1）將底物10-乙酰基-3,7-二羥基吩噁嗪和輔酶辣根過氧化物酶混合，采用PIPES緩沖溶液調節溶液的pH值；

（2）將不同濃度的溶解性多糖單加氧酶液分別加入到上述混合溶液中，在一定溫度條件下反應30min；在激發光560nm，發射光590nm條件下檢測熒光，以溶解性多糖單加氧酶的濃度為橫坐標，熒光增強速率為縱坐標作圖，繪制溶解性多糖單加氧酶酶活的標準曲線。

（3）按照步驟（1）、（2）將溶解性多糖單加氧酶粗酶液加入到10-乙酰基-3,7-二羥基吩噁嗪和輔酶辣根過氧化物酶混合液中，反應后檢測熒光，對照標準曲線計算粗酶液酶活。

所述的步驟（1）中10-乙酰基-3,7-二羥基吩噁嗪的濃度為10μM，輔酶辣根過氧化物酶濃度為30U/ml，PIPES緩沖溶液濃度為100mM，所述pH值為6 .0。

步驟（2）所述溶解性多糖單加氧酶酶液的濃度為0-20μg/mL，反應溫度為30℃，反應時間為30min。

上述方法的檢測限可至1ug/ml。